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zcqcau鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[交流]
【求助/交流】甘油菌的問(wèn)題 已有7人參與
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我將大腸桿菌按照2%的甘油濃度進(jìn)行混勻后，迅速液氮冷凍30S，然后放置于-80度冰箱。 1、不知道以上操作是否合理？ 2、保存菌液前是否需要測(cè)定OD值？ 3、是否需要保存后再挑取甘油菌進(jìn)行鑒定？看是否成功？ |
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sagast
鐵蟲 (小有名氣)
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zhang8826857(金幣+5): good 2011-11-24 08:57:28
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微 生 物 菌 種 保 藏 技 術(shù) CICC是我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，有近三十年菌種分類鑒定的歷史，擁有先進(jìn)的生物科學(xué)儀器和從事分類鑒定的專業(yè)化人員隊(duì)伍。CICC承擔(dān)全國(guó)工業(yè)微生物菌種的委托鑒定工作，所提供的菌種鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)服務(wù)獲得“國(guó)家工商總局（SCIC）經(jīng)營(yíng)許可”，為國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)、大專院校和生產(chǎn)企業(yè)等提供微生物菌種鑒定服務(wù)，涉及細(xì)菌、酵母、放線菌和絲狀真菌等多類微生物。菌種鑒定手段包括形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定、 BIOLOG碳源自動(dòng)分析鑒定、分子生物學(xué)鑒定、API細(xì)菌數(shù)值鑒定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄層層析、全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定、（G＋C）mol％測(cè)定、DNA/DNA同源性測(cè)定等。 定期移植法 液體石蠟法 沙土管法 真空冷凍干燥法 -80℃冰箱凍結(jié)法 液氮超低溫凍結(jié)法 回到頂部定期移植法 亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長(zhǎng)充分后，于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。 操作步驟如下： • 1 培養(yǎng)基制備 • 1.1 器皿準(zhǔn)備 培養(yǎng)基制備過(guò)程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。 • 1.2 溶解培養(yǎng)基配料 先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項(xiàng)材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。 • 1.3 調(diào)pH值 配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿(10%氫氧化鈉)調(diào)pH值。加酸或堿液時(shí)要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過(guò)堿或過(guò)酸而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確和營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。 • 1.4 加凝固劑 配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。 • 1.5 過(guò)濾分裝 在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過(guò)濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過(guò)程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。 • 1.6 包扎標(biāo)記 將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。 • 1.7 滅菌 根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。 • 1.8 斜面擺放 滅菌后及時(shí)擺放斜面，斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管管長(zhǎng)的二分之一為宜。 • 1.9 無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無(wú)菌檢驗(yàn)，通常30℃培養(yǎng)1～3天。無(wú)菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。 • 2接種 • 2.1 斜面接種 • 2.1.1 點(diǎn)接 把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長(zhǎng)及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。 • 2.1.2 中央劃線 從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。 • 2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。 • 2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。 • 2.1.5 挖塊接種法 挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。 • 2.2 穿刺接種 用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。 • 2.3 液體接種 挑取少量固體斜面菌種或用無(wú)菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。 • 3 培養(yǎng) 將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般為30～37℃，真菌培養(yǎng)溫度一般為25～28℃。 • 4 保藏 培養(yǎng)好的菌種于4～6℃保存，根據(jù)要求每3～6個(gè)月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個(gè)月移植一次。 保藏濕度用相對(duì)濕度表示，通常為50%～70%。 斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對(duì)照，防止因意外和污染造成損失。 回到頂部液體石蠟法 亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長(zhǎng)出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。 操作步驟如下： • 1 液體石蠟的準(zhǔn)備 選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌： 121℃濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無(wú)菌檢查后備用。 160℃干熱滅菌2個(gè)小時(shí)，冷卻后，經(jīng)無(wú)菌檢查后備用。 • 2 斜面培養(yǎng)物的制備 參照定期移植法。 • 3 灌注石蠟 將無(wú)菌的液體石蠟在無(wú)菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。 • 4 保藏 • 4.1 注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（4～6℃）干燥處保藏，保藏時(shí)間2～10年。 • 4.2 保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充無(wú)菌的液體石蠟。 • 5 恢復(fù)培養(yǎng) 恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。 回到頂部沙土管法 是載體保藏法的一種。將培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞或孢子用無(wú)菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細(xì)胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室溫進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。 操作步驟如下： • 1 沙土管制備 將河沙用60目過(guò)篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過(guò)篩，去掉細(xì)沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機(jī)物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時(shí)后倒去鹽酸，用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。 另取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過(guò)篩,水洗至中性，烘干。 將處理后的沙、土按質(zhì)量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30min。 隨機(jī)抽取滅菌后的砂土管若干支，無(wú)菌條件下取少許砂土至營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，檢查無(wú)微生物生長(zhǎng)后方可使用。 • 2 斜面培養(yǎng)物的制備 參照定期移植法。 • 3 制備菌懸液 向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入3～5mL無(wú)菌水，洗下細(xì)胞或孢子制成菌懸液。用無(wú)菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 • 4 干燥 真空抽去沙土管中水分。 • 5 保藏 將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(4～6℃)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度。或?qū)⑸惩凉苤苯佑门Ｆぜ埢蛩芰霞埌�，置干燥器�?nèi)保存。 保藏時(shí)間2～10年。 • 6 恢復(fù)培養(yǎng) 無(wú)菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出菌落后再轉(zhuǎn)接一次�；蛉∩惩亮Ｓ谶m宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面。 回到頂部真空冷凍干燥法 將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止，從而長(zhǎng)期維持存活狀態(tài)。 操作步驟如下： • 好氧菌冷凍干燥管的制備 • 1 安瓿管準(zhǔn)備 安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí)，先用2%鹽酸浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。 • 2 保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備 保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過(guò)濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。 • 3 凍干樣品的準(zhǔn)備 在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》（試行）），與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長(zhǎng)的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短，最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。 • 4 預(yù)凍 一般預(yù)凍2小時(shí)以上，溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。 • 5 冷凍干燥 采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。 將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時(shí)間一般為8-20小時(shí)。 • 6 真空封口及真空檢驗(yàn) 將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。 熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測(cè)定儀測(cè)定真空度。 • 7 保藏 安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。 • 8 質(zhì)量檢查 冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。 • 厭氧菌冷凍干燥管的制備 • 主要程序與需氧菌操作相同，注意保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備，保護(hù)劑使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護(hù)劑中的溶解氧。 • 復(fù)蘇方法 • —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， • —— 將安瓿管頂部燒熱， • —— 用無(wú)菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端， • —— 用無(wú)菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無(wú)菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)行適溫培養(yǎng)。 回到頂部-80℃ 冰箱凍結(jié)法 將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行冷凍的一種保藏方法。 操作步驟如下： • 1 安瓿管的準(zhǔn)備 安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí)，先用2%鹽酸浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。 • 2 保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備 保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過(guò)濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。 • 3 微生物保藏物的準(zhǔn)備 在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》（試行）），與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長(zhǎng)的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短，最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。 • 4 凍結(jié)保藏 將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。 • 5 復(fù)蘇方法 從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)快速搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。 回到頂部液氮超低溫凍結(jié)法 液氮超低溫保藏技術(shù)是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮，或在-150℃的氮?dú)庵械拈L(zhǎng)期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。 操作步驟如下： • 1 安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備 用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈， 121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。 • 2 保護(hù)劑的準(zhǔn)備 保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度，一般采用10-20%甘油。 • 3 微生物保藏物的準(zhǔn)備 微生物不同的生理狀態(tài)對(duì)存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。 分裝時(shí)注意應(yīng)在無(wú)菌條件下操作。 • 菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法： 刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)； 接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi)； 將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無(wú)菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)； 在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護(hù)劑，待保藏。 • 4 預(yù)凍 預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結(jié)到-35℃。 • 目前常用的有三種控溫方法： —— 程序控溫降溫法，應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率。 —— 分段降溫法：將菌體在不同溫級(jí)的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時(shí)，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。 —— 對(duì)耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。 • 5 保藏 將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。 • 6 復(fù)蘇方法 從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置在38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。 |
10樓2011-11-23 17:27:43
dhd997
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2樓2010-06-12 15:05:32
liyong1981 
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3樓2010-06-12 15:17:59
jasco
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4樓2010-06-12 16:02:30
zcqcau
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5樓2010-06-12 19:05:39
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6樓2010-06-13 23:15:00
dasheng1980
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8樓2011-11-23 16:54:43
sagast
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