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[交流]
【求助/交流】5-RACE問題 已有7人參與
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最近在做RACE，有些地方不太懂，請蟲友賜教！！ 1.做5-RACE時，要先將RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基團(tuán)，然后再去掉帽子，保留一個磷酸基團(tuán)，那第一步“將RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基團(tuán)，”是不是為了“去掉帽子”的需要？RNA的結(jié)構(gòu)是怎么樣的？ 2.接下來要加上接頭引物，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA后，進(jìn)行outer 和innner PCR，這里面的outer 和innner primer處在什么位置，它們離adaptor primer有多遠(yuǎn)啊，假如用outer primer擴(kuò)出帶后，那得到的這一段就是基因的5-末端嗎，再往前就沒有了嗎？ 謝謝！�。� 還有一個問題，5-RACE得到基因的5-末端后，與3-端結(jié)合到一起形成一個完整的基因，它的結(jié)構(gòu)除了ORF還有有哪些，5-端有沒有啟動子等結(jié)構(gòu)， [ Last edited by 小貓三兩只 on 2010-7-1 at 12:15 ] |
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3樓2010-07-01 12:07:20
won7
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看天(金幣+2):謝謝交流 2010-06-30 21:50:54
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1，你所說的RACE是RLM-RACE法，第一步“將RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基團(tuán)，”不是為了去帽子，是為了把不完整的mRNA和非mRNA的磷酸基團(tuán)去掉，這樣遮些RNA將無法與接頭連接，從而提高5RACE的效率，保證得到的片段都是完整的。這與SMART-RACE不同。帽子結(jié)構(gòu)有3個磷酸基團(tuán)（不完整的mRNA和非mRNA的沒有帽子結(jié)構(gòu)），去帽子時只去掉兩個基團(tuán)，保留一個，這是連接接頭必須的。 2， outer 和innner primer都是在接頭的位置，只是innner primer在outer primer前面一些堿基。從原理得知，用這個方法得到的是完整的5-末端，前面沒有了。 [ Last edited by won7 on 2010-6-30 at 21:53 ] |
2樓2010-06-30 21:49:44
won7
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小貓三兩只(金幣+5):非常感謝,現(xiàn)在清楚了 2010-07-01 15:35:18
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1,堿性磷酸酶能把裸露的磷酸基團(tuán)去掉，而完整的mRNA 5末端有帽子結(jié)構(gòu)保護(hù)，不能被去掉,用煙草酸焦磷酸酶可以去掉頭兩個磷酸，留下一個，便于與接頭連接。 完整mRNA: m7G-p-p-p-----------------------------------AAAAAAAA 不完整mRNA: PO4---------------------------------------AAAAAAAAAA 2，outer 和inner primer 不是在接頭附近，而是在接頭上。接頭也是一段RNA，接頭的序列是知道的，outer 和inner prime的序列也知道，試劑盒說明書提供序列，可以查看。由于接頭是RNA，所以不能直接作引物，下游肯定是GSP了。 3，啟動子序列是不被轉(zhuǎn)錄的，完整的mRNA不會有啟動子序列。 [ Last edited by won7 on 2010-7-1 at 12:48 ] |
4樓2010-07-01 12:45:48
5樓2010-07-01 15:37:05
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