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【分享】DNA膠回收中常見(jiàn)問(wèn)題和解答 已有2人參與
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1、如何計(jì)算提取率？ 1) 回收前樣品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用測(cè)回收前后吸光度的的方法計(jì)算回收率； 2) 可將回收前后DNA 片段一起電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，用配套的軟件進(jìn)行電泳條帶灰度對(duì)比； 3) 注意，電泳條件及拍攝條件將對(duì)灰度對(duì)比結(jié)果造成很大影響，請(qǐng)仔細(xì)操作，以減小誤差。 2、如何簡(jiǎn)易測(cè)算提取率？ 取膠回收后的DNA溶液體積的1/5—1/10，與等體積的回收前的DNA溶液的5—10倍稀釋液一起電泳，肉眼觀察回收后的條帶相對(duì)于回收前條帶的亮度，粗略測(cè)算回收率（如亮度只有一半時(shí)，其回收率可粗略為50%）。 3、如何看待提取得率？ 影響回收率的因素很多，如DNA片段大小、點(diǎn)樣量、凝膠種類、電泳緩沖液的緩沖能力、切膠操作、紫外燈照射強(qiáng)度和時(shí)間、溶膠是否徹底等等，所以不能單憑1-2次的實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷其質(zhì)量好壞，最好是多做幾次實(shí)驗(yàn)或用幾種不同品牌的產(chǎn)品做平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相對(duì)真實(shí)。 4、回收率為什么與點(diǎn)樣量和片段大小有關(guān)？ DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強(qiáng)，就越難洗脫，回收率就低；DNA的量越少，相對(duì)損失越大，回收率越低。 5、用膠回收試劑盒從凝膠中回收DNA得率低是什么原因？ 1） 膠塊溶解不完全，可適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間和上下顛倒的次數(shù)以及增加溶膠液的比例； 2） 膠塊體積太大，應(yīng)使用槍頭搗碎，還不能充分溶解則先將其切為小塊，分多次回收； 3） 紫外燈下切膠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致DNA部分降解，應(yīng)盡量把切膠時(shí)間控制在30s以內(nèi)； 4） 洗滌液使用后未及時(shí)蓋嚴(yán)瓶蓋，乙醇揮發(fā)，影響回收效率； 5） TAE或TBE電泳緩沖液不新鮮，失去了緩沖能力，導(dǎo)致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，應(yīng)及時(shí)更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液，效果更好。 6） 回收前的樣品量太少，加大點(diǎn)樣量 7） 洗脫前，預(yù)先65℃預(yù)熱洗脫液、延長(zhǎng)室溫靜置時(shí)間、增加洗脫次數(shù)可以有效提高回收率30%以上。 6、加入溶膠液溫浴后，液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象？ 1） 膠塊溶解不充分，可再補(bǔ)加一些溶膠液或延長(zhǎng)水浴時(shí)間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠； 2） 膠塊體積過(guò)大，應(yīng)盡量切除多余部分，并將其切為小碎塊，分幾次回收； 3） 水浴溫度是否達(dá)到規(guī)定溫度65℃，用溫度計(jì)檢測(cè)。 7、瓊脂糖凝膠塊不溶？ 1） 瓊脂糖質(zhì)量不好； 2） 含目的片斷的凝膠在空氣中放置過(guò)久，使膠塊失水干躁，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存于4 ℃或-20℃； 3） 制膠的電泳緩沖液濃度過(guò)高或陳舊。 8、點(diǎn)樣時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA樣品有漂出點(diǎn)樣孔外的現(xiàn)象？ 柱子上的乙醇未完全揮發(fā)干凈，延長(zhǎng)室溫下空柱靜置時(shí)間以確保乙醇完全揮發(fā)干凈。 9、能否使用去離子水洗脫回收？ 可以，但是實(shí)驗(yàn)室所用去離子水一般PH值偏低，可用NaOH適當(dāng)調(diào)高PH值＞7.0，以增加回收得率。 10、能否使用TE（PH8.0）洗脫？ 可以 11、可否使用小于30μl的洗脫液進(jìn)行洗脫？ 不可以。因?yàn)檎f(shuō)明書(shū)提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積。 12、關(guān)于DNA片段大小與回收率的問(wèn)題？ 100bp-500bp，30-60%；500bp-4kb，80-95%；4kb以上，30-50%。 13、OD值與瓊脂糖凝膠中的DNA產(chǎn)量不相符？ 從柱子上洗脫下來(lái)的痕量雜質(zhì)增加了A260的值。 14、吸光度純度測(cè)定時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？ 吸光度測(cè)量的是未知樣品與調(diào)零標(biāo)準(zhǔn)之間的相對(duì)吸光度，所以請(qǐng)用與洗脫液體相同的液體，對(duì)測(cè)量樣品進(jìn)行稀釋和調(diào)零。 15、為什么溶膠不徹底會(huì)影響回收結(jié)果的純度？ 在電泳過(guò)程中，DNA會(huì)與大分子的多糖緊密的結(jié)合在一起，凝膠的種類和質(zhì)量不同，DNA與之結(jié)合力也不同，只有凝膠充分溶解，DNA才能充分釋放，否則，凝膠將與DNA一起沉淀下來(lái)，洗脫后將影響回收結(jié)果的純度。 |
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3樓2018-04-09 10:20:35
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