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【分享】PCR產(chǎn)物中減少引物二聚體的方法 已有33人參與
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1. 從引物自身著手，重新設(shè)計引物，這是最根本解決這一問題的辦法； 2. 可能模板有問題； 3. 模板濃度過小，適當(dāng)加大模板量； 4. Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度； 5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻，這時再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會消失的； 6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強(qiáng)特異性； 7. PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加TAq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間，有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會將多余的引物合成為二聚體。 8. 增加循環(huán)數(shù)； 9. 降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長度而定，片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）； 10. 若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l沒有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對。 11. 以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50-100倍 |
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