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nancy1984木蟲 (小有名氣)
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[交流]
HPLC的砂芯漏斗，流動相，柱子保存問題
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剛開始進行HPLC實驗，同實驗室的人都不熟，只有在這求助各位親愛的蟲友了 1.不知道最標準的保存砂芯漏斗的方法是怎么樣的。我砂芯漏斗主要過濾的是色譜純的甲醇，乙晴，和水。我用完砂芯漏斗后，先用三次蒸餾水沖洗幾次，然后用干凈的紙巾包好，放進塑料袋內，在放抽屜保存。實驗室沒有什么防塵柜之類的。。。不知道這樣可不可以？因為試劑買來的都是MERK公司色譜純，我覺得應該都是很純的試劑。 2.我每次都是過慮大約1L的流動相，甲醇，乙晴，和水，放在進口的試劑瓶中。但連續(xù)用了兩次，也就是兩天都用不完。因為試劑很貴，我想以后每次都少過濾一點，500mL應該也夠一次用了的。但是一個師兄說，他們實驗室每次都用1L的容量。我也不知道他這樣子的依據是什么。我現在用完兩次，還都留有300mL左右，近幾天又不會再用。我想是不是必須倒掉，下次用之前再過濾新的，少過濾些，500ML的量就行。還是就可以放在室溫下保存，然后隔幾天用之前再超聲呢?這樣子，感覺瓶子又不干凈了。。。大家一般是配多少呢？ 3.我是分析有機物質，用C18的反相色譜柱。實驗樣品測完后，我先用水沖洗30min,在用乙晴沖洗1h，然后柱子就放在HPLC的儀器上，不取下來。因為近期那個儀器都是我用。雖然有時候是隔幾天。不知道這樣子對柱子影響大不大？還是必須取下來，兩端密封保存。 4. 另外，看有的人說，直接買的色譜純試劑，作流動相時可以不用砂芯漏斗過濾，真是這樣子嗎？  |
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nancy1984(金幣+1):謝謝~~ 2010-08-06 20:21:59
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1. 緩沖液的流動相，用前一定要過濾，可以用5號沙芯漏斗。漏斗用畢要清洗，如果長期不用建議在烘箱中110度烘一烘，起到滅菌作用。 用了含緩沖液的流動相，做完HPLC后，濾頭和管道建議用純水沖洗。 2. HPLC 流動相的緩沖液緩沖液流動相可以根據下面的操作步驟配制: 1. 將緩沖液藥品溶解在水中制成緩沖液(溶液 A) . 2. 用 pH 計確定或調節(jié)溶液 A 的 pH. 3. 將一定體積(如 200ml)的有機溶劑 B 與由步驟 2 配制的溶液 A(如 800ml)混合,制成最 終流動相(此處的有機相為 20%) . 4. 檢查最終流動相的 pH(此處為選項) . 由于測定含有有機調節(jié)劑的流動相 pH 計發(fā)生漂移,使其測定 pH 不很可靠,所以上面的步驟 4 一般只有在考察誤差的主要來源時采用,大多數實驗室皆略去此步驟. 步驟 1 一般是將配制緩沖液所用的兩種試劑(A1 和 A2)分別按計算量先溶解在水中制成水溶 液,然后再將這兩種溶液按一定的比例混合得到預期 pH 的溶液 A.若在此步驟 2 中調節(jié) pH,則可以 采用溶劑 A 滴定溶劑 B,也可反過來滴定,并通過 pH 計測量得到所需 pH 的最終緩沖溶液.在大多 數實驗室中,pH 的測量精度通常不會達到±0.05—0.1 個 pH 單位,這會顯著影響一些樣品的分離. 當 HPLC 方法對 pH 非常敏感時,步驟 2 只能大致確定 pH 值. 將準確稱重的緩沖液配制試劑與精確體積的脫氣蒸餾水混合,使其成為均一的溶液(不進一步 調整 pH) ,如此配得得緩沖溶液得 pH 可以控制在非常窄得范圍內(±0.02 單位) ,已知準確 pH 值得 緩沖液濃溶液已有市售. 為了改善峰形或塔板數,有時在流動相中加入酸或堿(如三乙胺,乙酸等) ,如果這些添加劑并 非為配制緩沖溶液時所采用得試劑,那么將這些試劑加入到流動相中后,還需重新滴加酸或堿,使 流動相達到所需的 pH 值. 常用緩沖液的配制 當緩沖液被稀釋或濃縮時,pH 也應不變.其 pH 值應近似恒定不變,或當其中的離解的陽離子 + + (K ,Na )或陰離子(Cl ,Br )被其它種類的離子替換時,表 1—4 中給出了響應的配制方法,平 + + 衡陽離子為 Na ,緩沖液的最終濃度為 0.1mol/l,對于其它濃度的緩沖溶液或陽離子種類(通常 K ) 更好,表中的數據也可供參考.較稀的或較濃的緩沖溶液,及包含有不同陽離子的溶液,其 pH 值會 與表中的數據稍有出入.在方法建立過程中,精確的流動相 pH 值往往并不重要,重要的是每次新配 制的流動相的 pH 值與第一次基本相同(最好控制在±0.02 范圍內) .注意,只有當緩沖溶液的 pH I 在緩沖試劑解離常數 pK a±1 范圍內時,緩沖溶液才具有有效的緩沖容量(如乙酸鹽的 pKa=4.6,其 適宜的 pH 范圍為 3.6—5.6) . 表 1 低 pH 值(25℃)磷酸鹽緩沖溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M 磷酸.配制精確 pH 值緩沖液時,所用磷酸需滴定 H3PO4 的含量. 溶液 A2:0.1M 磷酸二氫鈉溶液,稱量 13.8g NaH2PO4H2O 溶解于水中,定容于 1L 容量瓶中. pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) 2.0 565 435 2.8 175 825 2.2 455 545 3.0 110 890 2.4 345 655 3.2 55 945 2.6 250 750 表 2 不同 pH 值(25℃)醋酸緩沖溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M 醋酸溶液.6.0g(5.8ml)冰醋酸溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M 醋酸鈉溶液.8.2g C2H3O2Na(或 13.6g C2H3O2Na3H2O)溶解于水中定容到 1L 容量瓶中. pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) 3.6 926 74 4.8 400 600 3.8 880 120 5.0 296 704 4.0 820 180 5.2 210 790 4.2 736 264 5.4 176 824 4.4 610 390 5.6 96 904 4.6 510 490 表 3 不同 pH 值(25℃)檸檬酸緩沖溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M 檸檬酸溶液.21.0g 檸檬酸溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M 檸檬酸鈉溶液.29.4g C6H5O7Na32H2O 溶解于水中,定容到 1L 容量瓶中. pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) 3.0 930 70 5.2 360 660 3.2 870 126 5.4 320 680 3.4 810 190 5.6 270 726 3.6 750 260 5.8 230 764 3.8 700 300 6.0 190 810 4.0 660 340 6.2 140 856 4.2 610 370 6.4 60 940 4.4 560 440 6.6 40 960 4.6 510 490 6.8 30 970 4.8 460 540 7.0 10 985 5.0 410 590 表 4 中等 pH 值(25℃)磷酸緩沖液的配制方法 溶液 A1:0.1M 磷酸二氫鈉溶液.13.8g NaH2PO4H2O 溶于水中,定容到 1L 容量瓶中.溶液 A2:0.1M 磷酸氫二鈉溶液.26.8g Na2HPO47H2O(或 35.9g Na2HPO412H2O)溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) 5.6 948 52 7.0 390 610 5.8 920 80 7.2 280 720 6.0 877 123 7.4 190 810 6.2 815 185 7.6 130 870 6.4 735 265 7.8 85 915 6.6 685 315 8.0 53 947 6.8 510 490 表 5 和 6 給出了適于 pH=7—10.6 范圍的兩種有機堿緩沖液配制方法, 這種有機堿緩沖液可以有效低 減緩硅膠基柱的柱效降低. 表 5 高 pH(25℃)甘氨酸緩沖溶液的配制方法 溶液 A1:0.2M 甘氨酸.15.01g 甘氨酸溶于水中,定容于 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M NaOH 溶液,稀釋較濃的 NaOH 溶液. pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) pH A1 體積(ml) 8.6 25 2.0 9.6 25 8.8 25 3.0 9.8 25 9.0 25 4.4 10.0 25 9.2 25 6.0 10.4 25 9.4 25 8.4 10.6 25 表 6 高 pH 值(25℃)Tris 緩沖溶液的配制方法 溶液 A1:0.1M Tris(無堿) ,12.11g Tris 溶于水中,定容到 1L 容量瓶中. 溶液 A2:0.1M HCl 溶液,稀釋較濃 HCl 溶液. pH A1 體積(ml) A2 體積(ml) pH A1 體積(ml) 7.1 50 45.7 8.1 50 7.2 50 44.7 8.2 50 7.3 50 43.4 8.3 50 7.4 50 42.0 8.4 50 7.5 50 40.3 8.5 50 7.6 50 38.5 8.6 50 7.7 50 36.5 8.7 50 7.8 50 34.5 8.8 50 7.9 50 32.0 8.9 50 8.0 50 29.2 A2 體積(ml) 11.2 13.6 16.0 19.3 22.75 A2 體積(ml) 26.2 22.9 19.9 17.2 14.7 12.4 10.3 8.5 7.0 3. 緩沖液的配置（最佳方法） 1．將緩沖液藥品溶解在水中制成緩沖液(溶液A) 2. 用pH計確定或調節(jié)溶液A的pH。 3．將一定體積(如200mL)的有機溶劑B與由步驟2配制的溶液A(如800mL)混合，制成最終流動相(此處的有機相為20％) 4．檢查最終流動相的pH(此步驟為選項) 由于測定含有有機調解劑的流動相pH計發(fā)生飄移，使其測定pH不很可靠．所以上面的步驟4一般只有在考察誤差的主要來源時采用，大多數實驗室皆略去此步驟。 另 外要注意上表中調節(jié)劑的濃度，不適當的濃度和波長選擇，會造成基線本底吸收太高，基線不穩(wěn)，影響分析。要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作洗脫的 流動相。有些溶劑在一定的比例內互溶，超出一定的范圍后就不會互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨（pH5.16）做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時 就會出現不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%時就會分層等。當有機溶劑和緩沖溶液混合時還可能析出鹽的結晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。 |
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