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xiaomu3811金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】做touch down的專家能不能給小弟點建議
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各位蟲友，最近我做touch down PCR，想要將牛肝菌的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆出來，可試了好多次，均沒有明顯成功跡象�，F(xiàn)在我心里有點著急，所以想咨詢下各位蟲友，大家給點建議....謝謝.... 下面是我的pcr 反應體系：taq酶 0.5 uL 10*pcr buffer 5 uL dNTP 4 u L 簡并引物1（100p） 1 uL 簡并引物2（100p） 1 uL 模板（50ng/uL） 1 uL 補水 37.5 uL touch down 程序是： 94度 預變性 3分鐘 94度 變性 30秒 60度到57度 退火 1分鐘，并每降1度循環(huán)一次 72度 延伸 1分鐘 接著 94度 變性 30秒 56度到54度 退火 1分鐘，并每降1度循環(huán)四次 72度 延伸 1分鐘 再接著 94度 變性 30秒 50度 退火 1分鐘，并在此溫度循環(huán)20次 72度 延伸 1分鐘 最后在72度 運行 10分鐘，結(jié)束后4度保存 總共程序運行兩個小時左右，我設計的是簡并引物（2個正向+1個反向），想要克隆的片段是300bp和600bp， 但是電泳檢測有引物二聚體，并且還有個150左右bp大小的片段，就是沒有我所需要的片段。請問各位大俠，我該怎么辦呀....？ |
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