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嚇猴蹲木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】是非特異性吸附嗎？ 已有1人參與
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原理：以多聚酪氨酸多肽為底物，在ATP存在條件下，用提取的酪氨酸激酶催化底物酪氨酸的磷酸化，用酶標(biāo)記的單克隆抗體檢測酪氨酸磷酸化程度，以O(shè)PD做為辣根過氧化物酶底物顯色。 過程： 1.包被 多肽20mg/l包被96孔板，每孔100ul,4度過夜 2.封閉 150ul 5%BSA/PBS,37度2小時 3.洗板 20mmol/l PBST-20(0.05%),洗板5次，每次5分鐘 4.加入50ul 200ng/ml 的酪氨酸激酶溶液，25ul 5umol/l的ATP/MnCl2反應(yīng)5分鐘 5.加入25ul 500mM EDTA終止反應(yīng) 6.PBST洗板5次 7.加100ul 用1%BSA/PBS 1:1000稀釋的抗體，室溫反應(yīng)15分鐘 8.顯色 OPD溶液避光顯色，7分鐘 9.加入100ul 2.5N H2SO4終止反應(yīng) 10.讀數(shù) -ATP-Kinase-Ab+OPD OD值0.043 0.044 0.048 -ATP-Kinase+Ab+OPD 0.051 0.051 0.057 +ATP-Kinase+Ab+OPD 0.063 0.060 0.061 -ATP+Kinase+Ab+OPD 0.110 0.108 0.103 -ATP+Kinase-Ab+OPD 0.040 0.042 0.044 +ATP+Kinase+Ab+OPD 0.105 0.102 0.103 -ATP+Kinase+Ab+OPD+激酶抑制劑 0.070 0.068 0.075 +ATP+Kinase+Ab+OPD+激酶抑制劑 0.078 0.071 從結(jié)果來看，第4組與第6組OD值相當(dāng)，是否加ATP對結(jié)果無影響；第8組加激酶抑制劑，抑制激酶活性，阻礙底物發(fā)生磷酸化，OD值減小，但第7組，未加入ATP，加入激酶抑制劑結(jié)果與第8組OD值相當(dāng)。 1. 這會不會說明我的實驗原理是行不通的呢？ 2. Kinase在整個的過程中并未發(fā)揮使底物發(fā)生磷酸化的作用呢？ 沒轍了，請各位幫我分析分析�。「屑ぐ。� |
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2樓2010-11-20 17:50:13
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