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girlfisher金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】關于細菌定點突變技術
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目前正考慮做細菌的基因敲除，打算用定點同源重組技術進行�？戳藥滋熨Y料文獻有些問題，請了解的戰(zhàn)友幫忙解惑，謝謝！ 問題1：根據(jù)文獻，在進行帶有突變基因的自殺質(zhì)粒的大腸桿菌接合進行等位基因結(jié)合后，在此時為了消除作為基因供體的大腸桿菌，采用受體耐受但供體不耐受的抗性物質(zhì)來去除。這里受體細菌如果不存在任何抗性呢？難道先在受體細菌內(nèi)轉(zhuǎn)化一個抗性質(zhì)粒？可是質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化并非在所有細菌都可以做到。 問題2：采用自殺質(zhì)粒進行定點基因敲除是否對于所有或絕大多數(shù)革蘭氏陰性細菌對象都可以做到？ 問題3：我總結(jié)了一下用自殺質(zhì)粒進行細菌基因敲除的一般步驟，大家看看是否正確：首先獲得同源基因的序列并通過PCR獲得變異序列（可通過在序列內(nèi)插入一個抗性基因使其失活并帶上抗性），然后把變異序列插入自殺質(zhì)粒中并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入能夠復制該質(zhì)粒并能接合的大腸桿菌內(nèi)，將大腸桿菌與受體細菌一定比例混合接合一定時間，采用受體耐受供體不耐受的抗生素除去供體大腸桿菌，最后通過抗性平板或者PCR篩選鑒定陽性受體菌克隆。 |
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