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linjl010銀蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】如何檢測cDNA的質(zhì)量
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| 請問如何檢測cDNA的質(zhì)量，其中mRNA序列大約3000bp。另外，合成cDNA實驗中應(yīng)該注意什么？ |
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王會征
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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2樓2010-10-11 10:15:50
sjl2735
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3樓2010-10-11 10:57:00
ben1147
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4樓2010-10-11 16:29:43
5樓2010-10-11 19:48:55
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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[實驗原理] 總RNA，經(jīng)寡聚(d丁)纖維素親和層析柱分離出mRNA，以寡聚(d丁)為引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。先用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈；經(jīng)堿降解作用除去RNA模板后用大腸桿菌DNA聚合酶，以第一條鏈cDNA的3’末端結(jié)構(gòu)為引物合成第二鏈，最后形成雙鏈cDNA。 [儀器、材料與試劑] (一)儀器和材料 紫外線透射儀、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) (二)試劑 特異引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 [實驗步驟] （一）cDNA的合成 1、取約9uL mRNA，依次加入：第一鏈緩沖液4uL，RNA酶抑制劑1 uL，Oligo(dT)引物2uL，dNTP混合液2uL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2uL，混勻，離心10min，42℃水浴1h。 2、在冰上于第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物中，加入以下試劑：第二鏈緩沖液然40uL，RNA酶H 1uL，大腸桿菌DNA聚合酶5uL，DEPC處理過的水至100uL，混勻，離心10s，12℃、22℃、65℃水浴各1h。 3、加入T4DNA聚合酶，振蕩混勻后離心10s，37℃水浴10min。 4、加入10uL 200mmol／L EDTA和2ul SDS（10%，W/V） 5、加入80uLTE，20uL 3mol／L醋酸鈉，400uL乙醇，-20℃放置15min。 6、15000rpm 離心15min。 7、棄上清，稍晾干至無乙醇味，加40uLTE溶解沉淀，即為合成的cDNA。 （二）cDNA電泳檢測 取約5ul反應(yīng)產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外燈下檢測，呈現(xiàn)出大小在200—10Kb的拖帶，其中重心區(qū)域小1—4Kb之間，這說明反轉(zhuǎn)錄完全，得到了高質(zhì)量的cDNA。文章由英格恩博客提供 |
6樓2015-08-31 15:10:56
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