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【轉(zhuǎn)帖】常用貯存液的配制 已有1人參與
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轉(zhuǎn)帖：常用貯存液的配制 1．30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】 將29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。 【注意】 丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應戴手套和面具�？烧J為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。 一些價格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1 Mallinckrodt），攪拌過夜，然后用Whatman 1號濾紙過濾以純化之。 在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。 2．40%丙烯酰胺 【配制方法】 把380g丙烯酰胺（DNA測序級）和20g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應以蒸餾水補足至終體積為1L。 【注意】 見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測定。 3．放線菌素D溶液 【配制方法】 把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應放在包有箔片的試管中，保存于-20℃。 【注意】 放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時必須戴手套并在通風櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實驗桌面上進行，謹防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。 藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導作用。 4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液 【配制方法】 在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH調(diào)至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小份保存于-70℃ 5．10mol/L乙酸酰溶液 【配制方法】 把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。 6．10%過硫酸銨溶液 【配制方法】 把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4℃保存數(shù)周。 7．BCIP溶液 【配制方法】 把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃ 8．2×BES緩沖鹽溶液 【配制方法】 用總體積90ml的蒸餾水溶解1.07g鹽溶液BES[N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室溫下用HCl調(diào)節(jié) 該溶液的pH值至6.96、然后加入蒸餾水定容至100ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成小份，保存于-20℃。 9．1mol/L CaCl2溶液 【配制方法】 在200ml蒸餾水中溶解54g CaCl2•6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20℃。 【注意】 制備感受態(tài)細胞時，取出一小份解凍并用蒸餾水稀釋至100ml，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然后驟冷至0℃。 10．2.5mol/L CaCl2溶液 【配制方法】 在20ml蒸餾水中溶解13.5g CaCl2•6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。 11．1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）溶液 【配制方法】 用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20℃。 【注意】 DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。 12．脫氧核苷三磷酸（dNTP）溶液 【配制方法】 把每一種dNTP溶解于水至濃度各為100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/L Tris堿分別調(diào)節(jié) 每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH試紙檢測），把中和后的每種dNTP溶液各取一份作適當稀釋，在下表中給出的波長下讀取光密度計算出每種dNTP的實際濃度，然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP，分裝成小份貯存于-70℃。 堿基 波長（nm） 消化系數(shù)（ε）[L/（mol•cm）] A 259 1.54×104 G 253 1.37×104 C 271 9.10×103 T 260 7.40×103 比色杯光徑為1cm時,吸光度=εM 13．0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶液 【配制方法】 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na•2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié) 溶液的pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒）然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。 【注意】 EDTA二鈉鹽需加入NaOH將溶液的pH值調(diào)至接近8.0，才能完全溶解。 14．溴化乙錠（10mg/ml溶液） 【配制方法】 在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。 【注意】 小心：溴化乙錠是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時務必戴上手套，稱量染料時要戴面罩。 15．2×HEPES緩沖鹽溶液 【配制方法】 用總量為90ml的蒸餾水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4•2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH值至7.05，再用蒸餾水定容至100ml。用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成5ml小份，貯存于-20℃。 16．IPTG溶液 【配制方法】 IPTG為異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量為238.3），在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20℃。 17．1mol/L乙酸鎂溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L過濾除菌。 18．1mol/L MgCl2溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解203.4g MgCl2•6H2O，用水定容至1L，分裝成小份并高壓滅菌備用。 【注意】 MgCl2極易潮解，應選購小瓶（如100g）試劑，啟用新瓶后勿長期存放。 19．β-巰基乙醇（BME）溶液 【配制方法】 一般得到的是14.4mol/L溶液，應裝在棕色瓶中保存于4℃。 【注意】 BME或含有BME的溶液不能高壓處理。 20．NBT溶液 【配制方法】 把0.5g氯化氮藍四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。 21．酚/氯仿溶液 【配制方法】 把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L Tris•HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/L Tris•HCl(pH7.6)液層，保存于4℃。 【注意】 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重灼傷，操作時應戴手套及防護鏡，穿防護服。所有操作均應在化學通風櫥中進行。與酚接觸過的部位皮膚應用大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。 22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液 【配制方法】 用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20℃。如有必要可配成濃度高達17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）。 【注意】 PMSF嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。 PMSF在水溶液中不穩(wěn)定。應在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時，20μmmol/L PMSF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié) 為堿性（pH>8.6）并在室溫放置數(shù)小時后，可安全地予以丟棄。 23．磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液 【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié) 溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。 24．1mol/L乙酸鉀（pH7.5）溶液 【配制方法】 將9.82g乙酸鉀溶解于90ml純水中，用2mol/L乙酸調(diào)節(jié) pH值至7.5后加入純水定容到1L，保存于-20℃。 25．乙酸鉀溶液（用于堿裂解） 【配制方法】 在60ml 5mol/L乙酸鉀溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成鉀濃度為3mol/L而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。 26．3mol/L乙酸鈉（pH5.2和pH7.0）溶液 【配制方法】 在80ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié) pH值至5.2或用稀乙酸調(diào)節(jié) pH值至7.0，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。 27．5mol/L NaCl溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 28．10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液 【配制方法】 在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié) 溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。 【注意】 SDS的微細晶粒易擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS，10% SDS溶液無須滅菌。 29．20×SSC溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值至7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 30．20×SSPE溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解17.5g NaCl、27.6g NaH2PO4•H2O和7.4g EDTA，用NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值至7.4（約需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 31．100%三氯乙酸溶液 【配制方法】 在裝有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。 32．1mol/L Tris溶液 【配制方法】 在800ml水中溶解121.91g Tris堿，加入濃HCl調(diào)節(jié) pH值至所需值。 pH HCl 7.4 70ml 7.6 60ml 8.0 42ml 應使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。 【注意】 如1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應予丟棄并置備質(zhì)量更好的Tris。 盡管多種類型的電極均不能準確測量Tris溶液的pH值，但仍可向大多數(shù)廠商購得合適的電極。 Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1℃，pH值大約降低0.03個單位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃時的pH值分別為9.5、8.9和8.6。 33．Tris緩沖鹽溶液（TBS）（25mmol/L Tris） 【配制方法】 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris堿，加入0.015g酚并用HCl調(diào)至pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L，分裝后在151bf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，于室溫保存。 34．X-gal溶液 【配制方法】 X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。 雜交試驗中用于降低背景的封閉劑 試劑 用途 Denhardt試劑 Northern雜交 使用RNA探針的雜交 單拷貝序列的Southern雜交 將DNA固定于尼龍膜上的雜交 Denhardt試劑通常配制50×貯存液，過濾后保存于-20℃�？蓪⒃撡A存液10倍稀釋于預雜交液（常為含有0.5%SDS和100μg/ml經(jīng)變性被打斷的鮭精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分V”Sigmal），加水至終體積為500ml。 BLOTTO Grunstein-Hogness雜交 Benton-Davis雜交 除單拷貝序列Southern雜交以外的所有Southern雜交 斑點印跡 1×BLOTT（牛乳轉(zhuǎn)移技術(shù)優(yōu)化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%膠脂奶粉和0.02%疊氮鈉的水溶液，應保存于4℃。使用前可用預雜交液稀釋25倍。BLOTTO不應與高濃度的SDS并用，因為后者會導致牛奶中蛋白質(zhì)析出。如果雜交背景不合要求，可在雜交液中加入NP-40至終濃度為1%。BLOTTO不能用作Northern雜交的封閉劑，因為這一封閉劑中可能含有RNA酶，其活性之高使人無法接受。 注意：疊氮鈉有毒性，取用時需戴手套小心操作。含疊氮鈉的溶液應予明確標記。 肝素 Southern雜交 原位雜交 肝素（Sigma H-7005，從豬中提取的二級產(chǎn)品或相當?shù)燃壍漠a(chǎn)品）用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的濃度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的雜交液中用作封閉劑的濃度為500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的雜交液中的濃度為50μg/ml。 經(jīng)變性并被打斷的鮭精DNA southern和Northern雜交 把鮭魚精子DNA（Sigma,Ⅲ,鹽鈉）溶解于水配制成10mg/ml的濃度，必要時于室溫磁力攪拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的濃度調(diào)至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17號皮下注射針頭12次，以剪切DNA。加入2倍體積用冰預冷的乙醇沉淀DNA。離心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度，測定溶液的OD260值并計算出精確的DNA濃度，然后煮沸10min，分裝成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加熱5min，然后迅速在冰浴中驟冷。預雜交液中應含有100μg/ml經(jīng)變性并被打斷的鮭魚精子DNA |
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2樓2014-08-22 09:58:57
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