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beisimai895木蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制作方法 已有1人參與
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| 想做一批枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，之后用于電轉(zhuǎn)的，各位有什么好的方法嗎，給我看看。 |
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實(shí)驗(yàn)試劑： GM：LB+0.5M山梨醇 ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油 RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇 方法： 1）新鮮平板挑單菌落（小一點(diǎn)為好）接種于5ml LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。 2）測(cè)量搖管內(nèi)OD，控制好接種量，使接種完畢后培養(yǎng)基（50ml GM）的OD在0.19-0.2之間。37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600=1.0（大約3-4小時(shí)）左右。 3）取全部菌液冰水浴10 min，然后5000rpm，8min，4℃離心收集菌體。 4）用40ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液ETM洗滌菌體，5000rpm，8min，4℃離心去上清，如此漂洗3次。 5）將洗滌后的菌體重懸于等500μl的ETM中，每管分裝60μl。 6）將60μl感受態(tài)細(xì)胞中加入1-6 μl質(zhì)粒，冰浴孵育5min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯（1mm）中，電擊一次。電轉(zhuǎn)儀設(shè)置：2.0kv（另外我還嘗試過(guò)0.8kv，1.2kv），25μF，200Ω，1mm，電擊1次。（持續(xù)時(shí)間4.5ms-5ms之間） 7）電擊完畢立即加入1ml 復(fù)蘇培養(yǎng)基RM，37℃，200rpm，復(fù)蘇3h后，涂板。37℃，過(guò)夜培養(yǎng)。 |
2樓2014-02-11 13:43:24
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