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【求助/交流】Quantity One使用問題 已有6人參與
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| 誰知道用怎么用Quantity One分析條帶亮度，從而得出濃度呢？ |
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zhaohq1209
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amisking(金幣+5):good！ 2010-11-25 19:12:28
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1.創(chuàng)建泳道： a.打開我們要分析的電泳圖片（以蛋白質電泳為例）。 b.選擇“Lane-Auto Frame lanes”。這時如果您的電泳圖片比較標準的話，Quantity One就會自動識別出每條電泳泳道的位置，而且將各個泳道的路徑用一條紅線標畫出來； 如果您對軟件自動標記的泳道不甚滿意，您可以通過“Lane-Edit Frame”下級各個子菜單提供的功能對泳道框架位置、大小等進行調節(jié)；調節(jié)方法就是通過鼠標的拖放來實現(xiàn)。 如果您只需要分析其中幾個泳道的數據而不想其他泳道的標記干擾您的視線，您可以通過“Lane-Single Lane-Remove Lane”刪除您不需要的泳道的標記。 注意： 不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity One自動識別。在不能自動識別的情況下，QuantityOne就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面一樣，同過“Lane-Single Lane-CreatLane”來實現(xiàn)。只要用鼠標在您的電泳圖片上順著待標記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標記紅線。 2.不同泳道的背景排除： 我們要將我們的電泳圖片進行前面談到的泳道識別，不管是自動方式還是手工識別。然后選擇“Lane-LaneBackgroud...”命令。選擇該命令后，鼠標即變成一個綠色的“+”，將鼠標移到您打算進行背景排除的泳道，點擊左鍵一下，立刻就會彈出如下圖所示的對話框。 其中“OpticalDensity”顯示得是該泳道光密度值的分布情況。大家會注意到這個分布曲線并不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方分布。造成這個“懸空現(xiàn)象”的原因就是該泳道自身存在著一定的光密度“背景”。這個背景的存在導致該泳道上各個電泳條帶之間不能處于同一水平進行對比；如果考慮到相鄰的其他泳道更是因為不同背景的存在而無法對比不同泳道上的不同電泳條帶。如何去除這個背景呢？我們繼續(xù)看右邊的“Lane BackgroudSubstruction”對話框。這個對話框的上方“All Lanes”表示可以對所有泳道進行一次性處理；下方的“SelectedLane”表示僅針對此次選中的這個泳道進行處理。我們用鼠標選擇“Selected Lane”的“LaneOn”選項。然后在下面的“Rolling Disk Size”里填上“5”，再按“回車”鍵。大家再來看看現(xiàn)在“OpticalDensity”中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光密度曲線分布的醬色曲線。這條曲線將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布十分精確的劃分開來。 注意： “Rolling Disk Size”是什么意思呢？實際上就是數理里面的微分等差逼近。我們可以將QuantityOne提供的去除背景功能想象成是一個滾動的小球。如果這個小球的半徑越小，那么它沿著光密度曲線滾動時滾過的路徑就越發(fā)精細，具體反映在醬色曲線的軌跡越發(fā)靠近黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來說“Rolling DiskSize”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可以試著選擇一個較大的值比如80，再來看看此時醬色曲線的軌跡。當然也不能取太小的值。因為如果取值太小，大家可以想象這個十分微小的球就會滾入光密度曲線內部，造成有效陽性信號的損失。個人感覺5~20是一個比較好的取值范圍。 我們可以對每條泳道依葫蘆畫瓢進行以上類似的背景排除工作。不過有時候如果大家覺得可以使用同樣的標準，即相同的“Rolling DiskSize”進行排除，那么我們可以在“Lane Backgroud Substruction”對話框中選擇上方的“All LanesOn(same level)”選項。然后在“Rolling DiskSize”中填上一個合適的值，點擊“Done”按鈕確認就可以了。此時該電泳圖片上所有的泳道都以相同的標準進行了背景去除。 3.創(chuàng)建條帶： 前面我們已經識別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們開始研究電泳條帶的問題。首先在這里明確兩個名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band”指電泳條帶（在下文中一律使用這兩個英文名詞來表示這兩個意思）。 a.電泳條帶的識別：和前面研究Lane一樣，首先我們要對Lane上的Band進行識別。識別方式同樣分為自動識別和人工識別。自動識別的時候選擇“Band-Detect Bands...”命令。這時Quantity One會自動彈出一個“Detect Bands”的對話框。 注意： 第一次用QuantityOne時，您的Bands識別以后僅僅是畫出了一條紅色的粗線，而在上面的演示圖片中卻是上下括號的形式。其實大家可以在“Band-BandAttributes”選項中設置Bands的顯示形式。在下方的“Style”選項卡中選擇“Brackets”就會將原來的粗線改為括號形式了。 b.如果要自動識別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All”選項；如果僅僅想自動識別某一條Lane上的Bands就鉤選“One”，然后在后面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼； 如果僅僅想識別泳道上部分光密度值最強的Bands，可以在“Bands”后面的選項中選擇“Limit”，然后填上相應的數目（比如10）。Quantity One就會僅識別該泳道上光密度最大的10條Bands； 如果您發(fā)現(xiàn)自動識別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號內范圍小于黑色的光密度影。此時可以使用“LaneWidth”命令來調整Bands識別的寬度。用鼠標點擊“LaneWidth”后面的向上箭頭就會發(fā)現(xiàn)紅色括號逐漸變寬，最后要求其范圍略為寬過其包繞的Band影跡； 如果您發(fā)現(xiàn)自動識別功能沒有識別您想要的Band或者誤識別了您不想要的Band，您還可以使用上面的工具欄進行“添加”或“刪除”。將您的鼠標指向每個圖標，Quantity One就會知道彈出一個黃色的提示信息告訴您這個按鈕的功能。 4.高斯建模與結果分析： a.高斯建模，即用數學方法（微積分）對正態(tài)分布曲線進行統(tǒng)計分析。理論上每道band的光密度都呈正態(tài)分布的平滑曲線（每個band中間位置蛋白壓縮最緊濃度最高，向上向下因擴散而減弱）；然而實際操作過程中，如果熒光過強，往往出現(xiàn)類似方波的曲線（曲線無peak峰，上方為平滑直線，超識別的最高閾值）；熒光較弱宜出現(xiàn)波浪樣（多）波峰，或難與背景區(qū)分。 首先電腦會統(tǒng)計band中每個點的光密度值，并對這些值按正態(tài)分布進行歸類，當讀值不符合正態(tài)分布的原理時，電腦會自動做出選擇以對偏離正態(tài)分布的數據進行統(tǒng)計學取舍（置信區(qū)間），從而最終優(yōu)化光密度曲線呈正態(tài)分布。 如何進行高斯建模呢？很簡單，只要執(zhí)行“Band-Gauss Model Bands...”命令就可以了，執(zhí)行后QuantityOne回彈出一個對話框問您要對那條泳道進行高斯建模。請鉤選“One”，然后再輸入需要建模的泳道代碼就可以了；如果選擇了“All”則對所有泳道進行高斯建模，當然建模這么多泳道會費一點時間了。 b.觀察結果：執(zhí)行完高斯建模以后使用“Band-Band Information”命令來觀察結果。 方法是將變成藍色驚嘆號的鼠標移到剛才已經識別的Band的部位，一個詳細的“BandInformation”信息框就會立刻彈出來。在這幅圖中我們必須注意的是“Trace”和/或“Gauss ModelTrace”，因為我們剛才辛苦了半天就是為了得到這個數據。這個數據表示的就是Band光密度分布曲線下面積，也就是QuantityOne用來表達Band內分子總量的方式。 最后，我們計算、記錄的值，應該是“Gauss Model Trace”這一欄的讀值。 |
3樓2010-11-25 11:29:11
你好丫丫
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