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[交流]
【求助/交流】真核細胞總蛋白抽提
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各位高人： 目前正在做真核細胞的表達。用GFP質(zhì)粒表達的預(yù)實驗表明整個轉(zhuǎn)染及表達系統(tǒng)是沒有問題的，但是自己研究的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，卻在上清中檢測不到表達蛋白。初步推測有可能是信號肽不靈光，導(dǎo)致沒有外分泌到上清中。 于是想裂解一下293T細胞看是否在胞內(nèi)有表達，但是很難找到細胞裂解及抽提蛋白的溶液及步驟的資料，望各位高人指點，貢獻自己的方法及詳細步驟，配方。。。。謝過了先。。。 自己找的配方： Tris-HCl(pH8.0) 50 mmol/L NaCl 150mmol/L NaN3 0.02% PMSF 100ug/mL Aprotinin 1ug/mL TritonX-100 1% 使用前冰上預(yù)冷，加入裂解緩沖液后，冰浴20min。 刮取細胞裂解物，加入離心管中，4℃離心2min 取上清，測定值。。。。 [ Last edited by zplipeng on 2010-12-2 at 09:01 ] |
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2樓2010-11-30 12:55:25
zplipeng(金幣+7):nice，，，謝謝啦。。。 2010-12-05 16:21:30
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上海生工有！ 全蛋白提取試劑盒 Tissue or Cell Total Protein Extraction Kit 產(chǎn)品說明：本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液Lysis Buffer勻漿裂解組織或細胞，作用溫和，提取過程簡便高效,可以提取出培養(yǎng)細胞或動物組織中的決大多數(shù)蛋白質(zhì)。獲得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀，酶活性分析，Pull down,EMSA等后續(xù)研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑，可以每次從107個培養(yǎng)細胞或200mg動物組織提取蛋白質(zhì)，本試劑盒可以使用50次。儲存條件：2～8℃。 產(chǎn)品特點： 1．提取的蛋白質(zhì)包括膜,核,核基質(zhì)和胞質(zhì)蛋白,而且最大限度保持蛋白質(zhì)活性； 2．整個操作過程只需要30分鐘左右； 3．即可以用于培養(yǎng)細胞（50x107個），有可以用于動物組織（50x200mg）蛋白質(zhì)的提取； 4．避免蛋白酶和磷酸酶對蛋白質(zhì)的降解，保持蛋白質(zhì)的完整性和天然活性； 5．不需要超速度離心，可以同時處理多個樣品。 編號 包裝 價格 產(chǎn)地 BSP003 50 Assays 520 生工 RIPA裂解液I RIPA Lysis Buffer I 產(chǎn)品說明：RIPA裂解液I對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分均有較強的裂解作用，可能是經(jīng)典但最常用的細胞組織裂解液。使用RIPA Buffer制備用于Western特別是用于免疫共沉淀的裂解產(chǎn)物已經(jīng)是一種首選的標(biāo)準(zhǔn)操作，適用于大部分抗原表位的檢測，特別適用免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用胞漿磷酸化蛋白和細胞核轉(zhuǎn)錄因子檢測等。本產(chǎn)品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制劑組成.,為1倍溶液，可以處理108個細胞或1g組織。含((Tris-HCL,Nacl , deoxycholate,SDS ,NP-40), proteinase inhibitor and phosphatase inhibitor cocktail 。儲存條件：2-～8℃。 編號 包裝 價格 產(chǎn)地 PL005 10ml 225 生工 RIPA裂解液II RIPA Lysis Buffer II 產(chǎn)品說明：RIPA裂解液II對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分均有中等強度裂解作用，可能是經(jīng)典但最常用的細胞組織快速裂解液。使用RIPA Buffer制備用于Western特別是用于免疫共沉淀的裂解產(chǎn)物已經(jīng)是一種首選的標(biāo)準(zhǔn)操作，適用于大部分抗原表位的檢測，特別適用免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用胞漿磷酸化蛋白和細胞核轉(zhuǎn)錄因子檢測等。本產(chǎn)品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制劑組成. 為1倍溶液，可以處理108個細胞或1g組織。含有(NaCl,NP-40, deoxycholate, SDS,Tris), proteinase inhibitor and phosphatas inhibitor cocktail 。儲存條件：2～8℃。 編號 包裝 價格 產(chǎn)地 PL006 10ml 225 生工 RIPA裂解液III RIPA Lysis Buffer III 產(chǎn)品說明：RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)III對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分均有中等強度裂解作用，可能是經(jīng)典但最常用的細胞組織快速裂解液。使用RIPA Buffer制備用于Western特別是用于免疫共沉淀的裂解產(chǎn)物已經(jīng)是一種首選的標(biāo)準(zhǔn)操作，適用于大部分抗原表位的檢測，特別適用免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用以及胞漿磷酸化蛋白和細胞核轉(zhuǎn)錄因子檢測等,特別適用于核基質(zhì)和核轉(zhuǎn)錄因子的提取，也可以用于收集的線粒體中的活性蛋白質(zhì)的提取。本產(chǎn)品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制劑組成，含有EDTA，EGTA等成分，可以防止金屬蛋白酶的降解作用，但是不太合適于NI-NTA目的蛋白的純化和某些金屬酶活性研究，為1倍溶液，可以處理108個細胞或1g組織。含有(Tris-HCL , Nacl ,deoxycholate ,SDS，NP-40 , EDTA ，EGTA ), proteinase inhibitor and phosphatase inhibitor cocktail.儲存條件：2-～8℃。 編號 包裝 價格 產(chǎn)地 PL007 10ml 225 生工 RIPA裂解液IV RIPA Lysis Buffer IV 產(chǎn)品說明：RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)IV對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分均有較溫和的裂解作用，可能是經(jīng)典但最常用的細胞組織裂解液。使用RIPA Buffer制備用于Western特別是用于免疫共沉淀的裂解產(chǎn)物已經(jīng)是一種首選的標(biāo)準(zhǔn)操作，適用于大部分抗原表位的檢測，特別適用免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用胞漿磷酸化蛋白和細胞核轉(zhuǎn)錄因子檢測等。本產(chǎn)品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制劑組成. 為1倍溶液，可以處理108個細胞或1g組織。含有( Nacl ,Triton-x-100, deoxycholate, Tris ),proteinase inhibitor and phosphatase inhibitor cocktail儲存條件：2-～8℃。 編號 包裝 價格 產(chǎn)地 PL008 10ml 225 生工 Western及IP細胞裂解液 Western and IP Cell lysis Buffer 產(chǎn)品說明：是一種在非變性條件下裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解的細胞，可以用于SDS-PAGE，Western blot，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)，Western及IP細胞裂解液的主要成分為 Tris， NaCl，NP-40等，以及多種蛋白酶和磷酸酶抑制劑�？梢杂行б种频鞍椎慕到�，并維持原有的蛋白間相互作用。為1倍溶液，可以處理108個細胞或1g組織。儲存條件：2-～8℃。 編號 包裝 價格 產(chǎn)地 PL035 10ml 225 生工 |
3樓2010-12-05 15:27:41
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