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lhazrael木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】RNA干擾求助 已有3人參與
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最近剛接觸到RNA干擾，做的是絲狀真菌，問人家要了一個載體 這載體的特點是有兩個反向的啟動子，直接用PCR從全基因組中得到目的基因的片段，然后插入到這兩個啟動子之間，就可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生dsRNA，看起來挺方便的 我想問下目的基因序列已知，怎么選擇插入的片段呢？有什么特別的要求嗎？比如說長度，GC含量之類的。實驗室沒人做過，迷茫得很 請高手指導(dǎo)一下，不勝感激 附件是載體的圖片  |
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randomqd
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兩建議。
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dhd997(金幣+2):謝謝交流 2010-12-14 15:15:46
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dhd997(金幣+2):謝謝交流 2010-12-14 15:15:46
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一、現(xiàn)在有許多設(shè)計siRNA的網(wǎng)站，只要你把要沉默的目的基因放進(jìn)去，設(shè)好參數(shù)就好了。自己找人合成siRNA 給你個網(wǎng)址 http://sysbio.kribb.re.kr:8080/AsiDesigner/designedSirna.jsf 設(shè)計的原則，自己找。。 二、找公司設(shè)計。。。 沒做過真菌的沉默，不曉得它和動物有區(qū)別沒？ |
2樓2010-12-07 11:03:05
lhazrael
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4樓2010-12-14 15:16:09
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5樓2010-12-14 15:58:07
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6樓2010-12-15 08:39:30
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你的載體是兩個方向轉(zhuǎn)錄兩條，我之前做的是一條兩個短反向重復(fù)序列，在動物細(xì)胞體內(nèi)
★
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中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由polⅢ啟動子控制。隨后在連上5-6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。長度23個寡核苷酸可以更有效的；在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個C；ShRNA目的序列的第一個堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個G；中間的莖環(huán)，5'TCAAGAG3'序列最為有效(AMBION use)；5-6個T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄(stop)。；在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個或以上的T。 祝好 |
7樓2010-12-16 13:58:28
lhazrael
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8樓2010-12-16 14:17:56
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9樓2010-12-16 16:09:10
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10樓2010-12-16 16:42:26
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