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[交流]
【求助/交流】關(guān)于PCR產(chǎn)物和限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物跑出的電泳條帶的問題
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我在做一個snp基因分型的，用PCR—FRLP法，內(nèi)切酶用的是MSPI，位點是VKORC1-1639G>A,若基因型是AA型，則片段為290bp;若為AG型，則切出來的片段為290、122、168bp；若為GG型，則切出來的片段為168、122bp。上圖先。 從右邊數(shù)第2、3是PCR產(chǎn)物，6、7、8、9是這個位點的酶切產(chǎn)物。跑出來的電泳圖有幾個問題，1是位點的PCR非特異擴增很嚴重，但是我的退火溫度已經(jīng)為63°C了，不知道還能改進哪些？2是最亮的條帶明顯超過了290bp，在300bp左右了都，但是PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物位置還差不多，是不是因為邊緣效應(yīng)呢？不明白為什么？ 3是兩邊的maker跑的都不對稱。哎，期待回答�。�！感激不盡！ |
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qixinkumu(金幣+1): 2010-12-09 01:13:49
rainwander(金幣+2):鼓勵積極參與~~~ 2010-12-09 08:27:01
qixinkumu(金幣+4): 2011-04-25 20:18:23
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qixinkumu(金幣+4): 2011-04-25 20:18:23
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電泳要跑的平的話電壓一定要在5V/cm以下，電泳二十五分鐘以上，兩根電極鉑絲之間的距離一般是15cm。所以是75V，半小時 至于PCR的非特異建議使用常規(guī)優(yōu)化常用的冷啟動和降落PCR，鎂離子濃度也可以減低一點點試試，多態(tài)性分析..你這個引物應(yīng)該是文獻上的吧..如果是就參考一下別人，如果是自己設(shè)計的可以重新找一段設(shè)計，解決這個問題 嘿嘿 |
2樓2010-12-09 00:57:47
3樓2010-12-14 22:15:19
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