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[交流]
【求助/交流】PCR遇到的問(wèn)題
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各位同仁，大家好！最近我一直在PCR，可是一直沒(méi)有很亮的目的條帶出現(xiàn)或者目的條帶很模糊，非特異性擴(kuò)增很嚴(yán)重！我想用目的條帶做下一步PCR的模板，導(dǎo)師給我設(shè)置的兩個(gè)引物，其中一條28個(gè)堿基，另一條58個(gè)堿基，后者還有兩個(gè)突變堿基，分裂為三片段，長(zhǎng)度為23，13，20。模板是質(zhì)粒，已經(jīng)跑膠驗(yàn)證，質(zhì)粒質(zhì)量不錯(cuò)。Pfu, rTaq, ExTaq這三種酶都已經(jīng)試過(guò)，pfu能擴(kuò)增出目的條帶，但是條帶模糊，非特異性嚴(yán)重，rTaq能擴(kuò)增出目的條帶，但較模糊，引物二聚體嚴(yán)重，特異性擴(kuò)增較好。Extaq 沒(méi)有目的條帶，只有引物二聚體。其他的加樣基本上都是按照使用說(shuō)明書(shū)加的，也征求過(guò)師兄師姐的建議�？墒墙Y(jié)果還是那個(gè)樣，跟導(dǎo)師討論，他讓我自己探索條件。退火溫度我也已經(jīng)升到62度了，我也嘗試過(guò)菌落PCR，可還是老樣子。下一步的打算就是設(shè)個(gè)退火溫度梯度，但愿會(huì)出來(lái)理想結(jié)果……不知各位同仁有什么建議沒(méi)？不勝感激……我是新手，請(qǐng)大家伙不吝賜教…… |
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