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[交流] 【求助/交流】反敲除

請問FRT位點都是一樣的嗎？我對我敲除后的菌進行測序發(fā)現(xiàn)FRT位點處有一個突變會不會對反敲除有影響吶謝謝

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1樓 2010-12-16 20:27:46

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susizheng

木蟲 (著名寫手)

會不會是測序的誤差，先反敲除著看看。

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2樓2010-12-16 21:25:22

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scelab

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Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46:
請問FRT位點都是一樣的嗎？我對我敲除后的菌進行測序發(fā)現(xiàn)FRT位點處有一個突變會不會對反敲除有影響吶謝謝

什么叫反敲除

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3樓2010-12-16 21:44:29

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susizheng

木蟲 (著名寫手)

★
wwdxx2004(金幣+1): 2010-12-17 20:54:13
dhd997(金幣+1):good 2010-12-18 13:53:13

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Originally posted by scelab at 2010-12-16 21:44:29:

什么叫反敲除

反敲除，就是轉入抗性片段敲除基因后，轉入pCP20表達FLP重組酶，利用抗性片段兩端的FRT序列將抗性標記刪除。

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4樓2010-12-17 09:19:24

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Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:19:24:

反敲除，就是轉入抗性片段敲除基因后，轉入pCP20表達FLP重組酶，利用抗性片段兩端的FRT序列將抗性標記刪除。

對于pCP20和FLP重組酶，沒概念

有相關資料介紹下么

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5樓2010-12-17 09:23:56

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susizheng

木蟲 (著名寫手)

★ ★
scelab(金幣+2):謝謝噢~~~你們看的都是nature級的文章，很強大~~~ 2010-12-17 09:53:33
wwdxx2004(金幣+1): 2010-12-17 20:54:21

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Originally posted by scelab at 2010-12-17 09:23:56:

對于pCP20和FLP重組酶，沒概念

有相關資料介紹下么

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). "☆Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs." Nucleic Acids Res 38(6): e92.
比較經(jīng)典的是介紹pKD46這個敲除系統(tǒng)的，暫時沒找出來。

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6樓2010-12-17 09:36:42

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★ ★ ★
wwdxx2004(金幣+1): 2010-12-17 20:57:23
scelab(金幣+3):謝謝交流！:tiger06: 2010-12-17 23:15:56

1樓說的有可能，測序出來結果誤差的可能性還是很大的，因為對于Flp/FRT系統(tǒng)，具有良好的穩(wěn)定性，你的“反敲除”只是一個pCP20的轉化熱擊表達消除抗性基因片段的過程，不麻煩的，如果真的是FRT位點的一個突變，即使抗性基因消除以后，F(xiàn)RT還是會留在序列上，對后期的發(fā)酵有沒有影響還是不好說的。呵呵~~希望是測序的問題

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7樓2010-12-17 10:06:27

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現(xiàn)在的問題是PCP20丟不了，反敲也沒有成功，看文獻報道反敲成功幾率挺大的，但是到目前為止，沒有結果，也不知道那塊有問題

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8樓2010-12-17 20:59:13

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ben1147

木蟲 (正式寫手)

引用回帖:

Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:36:42:

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). ...

當年本科畢設用pKD46的時候稀里糊涂就用了，壓根什么都不明白。現(xiàn)在想想那時候真是無知者無畏，哈哈

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9樓2010-12-17 22:54:46

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wwdxx2004(金幣+1): 2010-12-18 13:17:28
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引用回帖:

Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-17 20:59:13:
現(xiàn)在的問題是PCP20丟不了，反敲也沒有成功，看文獻報道反敲成功幾率挺大的，但是到目前為止，沒有結果，也不知道那塊有問題

pCP20在42攝氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的話，重新做一次重組敲除好了，不麻煩的，這樣能排除FRT位點突變的可能了。為什么一定要測序的？不是很浪費嗎？電泳跑膠條帶沒問題就可以了

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10樓2010-12-18 12:33:00

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Originally posted by 最愛花詩雨 at 2010-12-18 12:33:00:

pCP20在42攝氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的話，重新做一次重組敲除好了，不麻煩的，這樣能排除FRT位點突變的可能了。為什么一定要測序的？不是很浪費嗎？電泳跑膠條帶沒問題就可以了

重新做一次重組敲除，還是比較麻煩的，我們實驗室的做了好久都沒有敲掉，我是比較幸運，敲除了，但是一直被反敲麻煩著，其實這樣還不如重做一次敲除呢，不知道金蟲敲除有什么高招？

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11樓2010-12-18 13:20:50

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Originally posted by susizheng at 2010-12-16 21:25:22:
會不會是測序的誤差，先反敲除著看看。

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20質(zhì)粒不行，每次提的PCP20跑膠條帶都很弱，轉化倒是沒什么問題，就是完成不了重組，不知道木蟲有什么更好的建議，謝謝！

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12樓2010-12-19 11:12:39

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★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流

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Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-18 13:20:50:

重新做一次重組敲除，還是比較麻煩的，我們實驗室的做了好久都沒有敲掉，我是比較幸運，敲除了，但是一直被反敲麻煩著，其實這樣還不如重做一次敲除呢，不知道金蟲敲除有什么高招？

敲除，對于大腸桿菌，Red同源重組是比較好用的方法了，通常情況下，會出現(xiàn)在重組環(huán)節(jié)，不過，你為什么一定要反敲除呢？留著那個抗性基因影響很大嗎？

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13樓2010-12-20 09:16:28

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Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-19 11:12:39:

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20質(zhì)粒不行，每次提的PCP20跑膠條帶都很弱，轉化倒是沒什么問題，就是完成不了重組，不知道木蟲有什么更好的建議，謝謝！

pCP20質(zhì)粒，本來濃度就不會很高的，但不會影響轉化效率。

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14樓2010-12-20 09:17:48

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xiuluokemo

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★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

引用回帖:

989437樓: Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46
請問FRT位點都是一樣的嗎？我對我敲除后的菌進行測序發(fā)現(xiàn)FRT位點處有一個突變會不會對反敲除有影響吶謝謝

可以跟我講講你做red敲除的經(jīng)驗嗎？最近做這個，涂板發(fā)現(xiàn)板上什么東西都沒長！

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15樓2012-08-21 10:48:10

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