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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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[交流] 【求助/交流】在5'端掛一個尾巴

為了將兩對引物擴(kuò)增后,電泳跑的條帶區(qū)分開,我想在其中一條引物的5'端掛一段其他物種的序列,但是不知道怎么找這樣的序列?

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1樓 2010-12-17 20:25:01

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三磷酸腺苷

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)

神馬？看不懂你的問題~~能不能詳細(xì)解釋下實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

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2樓2010-12-17 20:56:44

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yixuanwin

鐵桿木蟲 (正式寫手)

或者我理解的不對，能不能一次擴(kuò)增一個引物？

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3樓2010-12-17 20:58:38

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Originally posted by yixuanwin at 2010-12-17 20:58:38:
或者我理解的不對，能不能一次擴(kuò)增一個引物？

這個當(dāng)然是可以的,我只是想優(yōu)化下,爭取一次PCR 加一次電泳就可以區(qū)分開條帶...

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4樓2010-12-17 21:22:59

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-17 20:56:44:
神馬？看不懂你的問題~~能不能詳細(xì)解釋下實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

是這樣的,這兩對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小是一樣的,我想在其中一條引物上加個尾巴之類的,已達(dá)到在電泳時候在同一泳道上能區(qū)分開條帶的目的?

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5樓2010-12-17 21:25:40

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ben1147

木蟲 (正式寫手)

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金幣+5):熱心蟲友，歡迎多來交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-17 23:15:27
xwsooo(金幣+1):謝謝啦 2010-12-18 09:42:59

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Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 21:25:40:

是這樣的,這兩對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小是一樣的,我想在其中一條引物上加個尾巴之類的,已達(dá)到在電泳時候在同一泳道上能區(qū)分開條帶的目的?

這個看你目的片段多大以及跑什么樣的膠了。因?yàn)橐锷想m然可以附加序列，但是畢竟就那么幾十bp，如果本身片段好幾百上k，跑的是瓊脂糖膠的話，附加的這點(diǎn)長度肯定看不出來或者很難分辨。要是本身擴(kuò)增的條帶很短，二、三百左右，引物再長個幾十，用PAGE跑應(yīng)該是能分開的

不知道你要這樣分開的目的是什么。如果僅僅是湊巧兩對引物擴(kuò)增產(chǎn)物一樣長的話重新設(shè)計一下引物，改變其中一對的擴(kuò)增長度不就行了么。

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6樓2010-12-17 22:53:01

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Originally posted by ben1147 at 2010-12-17 22:53:01:

這個看你目的片段多大以及跑什么樣的膠了。因?yàn)橐锷想m然可以附加序列，但是畢竟就那么幾十bp，如果本身片段好幾百上k，跑的是瓊脂糖膠的話，附加的這點(diǎn)長度肯定看不出來或者很難分辨。要是本身擴(kuò)增的條帶很 ...

我明白您的意思，重新設(shè)計引物我也想過，但是這引物真不好弄到合適的，在primer-blast特異性好的就找到現(xiàn)在這樣的了，我的目的產(chǎn)物在140bp 左右，跑瓊脂糖凝膠。。。這尾巴的長度應(yīng)該有所限制吧？怎么樣設(shè)計才不影響引物本身，又不會使這尾巴與目的序列以外的片斷非特異性結(jié)合呢？？/

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7樓2010-12-18 09:46:47

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三磷酸腺苷

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首先這個產(chǎn)物的片段不能太大，我估計假設(shè)200bp以下應(yīng)該能做到

很簡單，把其中一對引物接長，無論什么序列都可以，你可以大膽地各接長10nt

然后只能跑PAGE膠了，因?yàn)榄傊欠?0bp以下的條帶就很困難了，容易誤判

現(xiàn)在你只是差別20bp。再長可能會嚴(yán)重影響擴(kuò)增效率

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8樓2010-12-18 10:02:46

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xwsooo(金幣+1):灰常感謝 2010-12-18 11:38:31

如果你怕非特異，加上GC clamp
或者形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)
加莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠接更長，估計上20nt應(yīng)該沒問題
這樣兩側(cè)加起來就有40bp了，跑3%甚至5%的瓊脂糖應(yīng)該能和你的140分開

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9樓2010-12-18 10:04:46

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-18 10:04:46:
如果你怕非特異，加上GC clamp
或者形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)
加莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠接更長，估計上20nt應(yīng)該沒問題
這樣兩側(cè)加起來就有40bp了，跑3%甚至5%的瓊脂糖應(yīng)該能和你的140分開

謝謝您的解釋，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)是什么意思？兩側(cè)都加？

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10樓2010-12-18 11:40:39

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xwsooo(金幣+1):謝謝 2010-12-18 15:47:16

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Originally posted by xwsooo at 2010-12-18 11:40:39:

謝謝您的解釋，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)是什么意思？兩側(cè)都加？

莖環(huán)結(jié)構(gòu)的話，你可以參考miRNA實(shí)時定量的逆轉(zhuǎn)錄引物

在5端加個莖環(huán)，3端不用
正向和反向的引物都加，就能延長很多了

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11樓2010-12-18 12:57:34

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xwsooo(金幣+1):謝謝 2010-12-18 15:47:08

有點(diǎn)兒問題，第一加了之后引物變長，很容易有不可預(yù)測的二聚體和非特異擴(kuò)增。其次瓊脂糖電泳雖然理論可以分開，但是實(shí)際操作有難度，聚丙烯酰胺凝膠電泳倒是可以。
如果實(shí)驗(yàn)室有條件，建議用real-time吧看melting curve，用sybegreen 或者syto9，很經(jīng)濟(jì)的

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Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 20:25:01:
為了將兩對引物擴(kuò)增后,電泳跑的條帶區(qū)分開,我想在其中一條引物的5'端掛一段其他物種的序列,但是不知道怎么找這樣的序列?

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12樓2010-12-18 13:05:59

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-18 12:57:34:

莖環(huán)結(jié)構(gòu)的話，你可以參考miRNA實(shí)時定量的逆轉(zhuǎn)錄引物

在5端加個莖環(huán)，3端不用
正向和反向的引物都加，就能延長很多了

miRNA實(shí)時定量的逆轉(zhuǎn)錄引物這個對于我來說不懂

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13樓2010-12-18 15:47:59

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Originally posted by yydopcr at 2010-12-18 13:05:59:
有點(diǎn)兒問題，第一加了之后引物變長，很容易有不可預(yù)測的二聚體和非特異擴(kuò)增。其次瓊脂糖電泳雖然理論可以分開，但是實(shí)際操作有難度，聚丙烯酰胺凝膠電泳倒是可以。
如果實(shí)驗(yàn)室有條件，建議用real-time吧看meltin ...

您說的是HRM吧？不知道roche的480做這個效果怎么樣？sybegreen 或者syto9
是非飽和染料吧？

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14樓2010-12-18 15:49:27

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