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【其他】多肽合成常見問題及參考意見 已有2人參與
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常見問題及參考意見 Q：銳東生物對(duì)本公司的產(chǎn)品是如何監(jiān)控的？ A ：所有合成肽都經(jīng)過(guò)HPLC和MS分析，除MALDITOF 外，由于肽在不同的質(zhì)譜儀中，能按其本身的序列進(jìn)行離子化，我們可以運(yùn)用HPLC-MS技術(shù)對(duì)HPLC中那些離子化的峰進(jìn)行分析。我公司多肽合成的技術(shù)裝備[MALDI-MS，HPLC-(ESI)MS（離子阱和四極管陣列）]為分析提供可靠的保證。 Q：請(qǐng)介紹一下你們的純化策略 A：我公司合成的多肽是用制備型反相HPLC進(jìn)行純化的，所用的兩種流動(dòng)相中都添加了TFA，pH=2。A相是0.1% TFA于超純水中，B相是0.1% TFA 于ACN 中，pH=2。樣品可以直接用A相溶，或者先用少量B相溶解再用A相稀釋。有時(shí)可能需要用強(qiáng)溶劑如甲醇、乙酸等來(lái)溶解疏水肽，具體采用哪種方法要看肽序列。在pH 6.8 時(shí)一般很難將肽溶解也很難進(jìn)行純化，因此我們一般是先將肽溶解再用兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。所用的pH 6.8的緩沖液為10 mM醋酸銨于超純水中（流動(dòng)相A），純ACN（流動(dòng)相B）。通過(guò)紫外檢測(cè)器在220 nm處檢測(cè)，收集不同組分并用MADLI-TOF MS進(jìn)行成分鑒定，用反相 HPLC分析純度，然后把目的肽凍干，將凍干的肽合并裝入小瓶中，最后，再對(duì)合并后的產(chǎn)物進(jìn)行MS和HPLC分析。 Q：如何解釋MALDI(MS)中的P+Na 和P+K峰？ A：經(jīng)常會(huì)在MALDI中看到Na峰和K峰，鈉和鉀來(lái)源于溶劑水。即便是蒸餾水和去離子水也會(huì)含有痕量的鈉離子和鉀離子，無(wú)法完全除去。它們?cè)谶M(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)也會(huì)離子化并與肽的自由羧基結(jié)合。因?yàn)闆]有純化水的系統(tǒng)將水中的鈉離子和鉀離子除去，所以有時(shí)候在MALDI MS圖譜中出現(xiàn)鈉峰和鉀峰也是再所難免的。 Q：合成肽在長(zhǎng)度上有何限制？ A：我公司合成的多肽長(zhǎng)度為2～128個(gè)氨基酸。標(biāo)準(zhǔn)的固相合成程序一般能合成2～90個(gè)氨基酸的多肽。 Q：肽的純度能達(dá)到多少？我的實(shí)驗(yàn)需要多少純度？ A：我公司可以提供不同的純度級(jí)別供客戶選擇，從粗品到>98%純度。根據(jù)客戶需要我們可以提供純度>98%的超純多肽。各種純度及應(yīng)用范圍如下：>70%，用于免疫實(shí)驗(yàn)和不敏感的篩選實(shí)驗(yàn) >80%，用于免疫實(shí)驗(yàn)和不敏感的篩選實(shí)驗(yàn) >90%，用于SAR研究和生物檢測(cè) >95%，用于NMR，晶體結(jié)構(gòu)研究及生物檢測(cè) >98%，用于NMR，晶體結(jié)構(gòu)研究及敏感的生物檢測(cè) Q：什么是凈重？什么是肽含量？ A：肽凍干后一般呈現(xiàn)為蓬松的絨毛狀，由于肽本身的特性決定了其中可能仍然含有痕量的水分、吸附的溶劑及鹽分等。這不代表肽的純度不夠，僅僅是影響肽的實(shí)際含量，使其降低了10%～30%。肽的凈重是指肽的實(shí)際重量減去水分和質(zhì)子化離子后的重量。為保證肽的濃度，需要從粗品肽中把非肽物質(zhì)去除。 Q：銳東生物如何運(yùn)輸多肽？都提供哪些檢測(cè)報(bào)告？ A：所有凍干的多肽都盛放在1 .2 ml或4ml的螺旋蓋小塑料管里，都附帶有原始的分析數(shù)據(jù)和合成報(bào)告單，上面包含有多肽的序列、分子量、純度、重量、編號(hào)等重要信息。外面包裝盒里有隔熱泡沫，然后再在泡沫盒里放冰袋；盡量保證運(yùn)輸過(guò)程中的溫度；以保障多肽的活性。 Q：什么樣的保存條件是最好的？多肽的穩(wěn)定性怎樣？ A：多肽凍干后呈絨毛狀或絮狀粉末，可避免多肽的過(guò)早降解。建議貯存條件為： ①.零下20℃貯存或者在干燥環(huán)境中通氮?dú)赓A存 ②. 盡量避免反復(fù)凍溶 ③. 盡量避免以溶液狀態(tài)貯存（為使用方便可以將凍干粉分裝后貯存） ④. 如果必須以溶液狀態(tài)貯存，建議用無(wú)菌水在弱酸性條件下溶解多肽并于-20℃貯存. Q：如何溶解多肽？ A：多肽的溶解度主要取決于其一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，修飾標(biāo)記的性質(zhì)及溶劑類型和終濃度。如果肽難溶于水，超聲可以助溶。對(duì)于堿性肽，建議用10 % 乙酸溶解；對(duì)于酸性肽，建議用 10%NH4HCO3溶解。不溶于水的多肽也可以添加有機(jī)溶劑助溶。用最少量的有機(jī)溶劑（如 DMSO、DMF、異丙醇、甲醇等）將肽溶解，一般溶解先將肽溶于有機(jī)溶劑中，然后緩慢加入水或其它緩沖液直至所需濃度。 Q：銳東生物www.rdpeptide.com能合成哪些修飾標(biāo)記的多肽？ A ：我公司提供多種修飾標(biāo)記的多肽，如乙�；⑸锼貥�(biāo)記、磷酸化修飾、熒光修飾，也可以根據(jù)您的特殊需要定制不同的修飾以及小分子修飾。 Q：哪種末端最適合研究？ A：肽的末端默認(rèn)為N端游離的氨基，C端游離的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列，為了與母本蛋白更為接近，肽末端往往需要封閉，即N端乙�；�，C端酰胺化，這種多肽合成修飾避免引入多余電荷，也使其更能防止外切酶作用，使肽更加穩(wěn)定。 Q：為什么要進(jìn)行N端乙�；�，C端酰胺化修飾？ A：這些修飾可以使肽不會(huì)被降解掉，也可以使肽模擬它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始狀態(tài)。 Q：就磷酸化肽的設(shè)計(jì)能不能給出一些建議？ A：隨著長(zhǎng)度的增加，從磷酸化的那個(gè)氨基酸往后偶聯(lián)效率逐漸降低。合成方向從C端到N端，建議磷酸化的那個(gè)氨基酸以后的殘基不要超過(guò)10 個(gè)，也就是說(shuō)從N端往C端數(shù)磷酸化氨基酸之前的氨基酸殘基最好不要超過(guò)10個(gè)。 Q：如果想在N端做生物素修飾，需要在生物素和肽序列之間加一個(gè)間隔嗎？ A ：我公司采用的標(biāo)準(zhǔn)的生物素標(biāo)記程序是先往肽鏈上連一個(gè)Ahx，然后再連生物素。Ahx是一個(gè)6碳化合物，把它加在肽和生物素之間起到間隔的作用；但也可以根據(jù)您的要求，中間不加Ahx。 Q：是不是在肽和修飾標(biāo)記的染料之間都需要加一個(gè)間隔？ A：如果你打算將一個(gè)大分子（如某種染料）連到肽上，最好在肽和配體之間設(shè)一個(gè)間隔，以盡量減少肽本身的折疊作用或者其偶聯(lián)物的折疊作用對(duì)受體造成的干擾。也有人不希望間隔的存在，例如，在蛋白質(zhì)的折疊研究中，可以通過(guò)確定將熒光染料連在某個(gè)氨基酸的某個(gè)位點(diǎn)上來(lái)研究二者在折疊結(jié)構(gòu)上相距多遠(yuǎn)。 Q：我需要合一條環(huán)肽，其中含有一個(gè)色氨酸，它會(huì)被氧化嗎？ A：色氨酸的氧化是肽氧化中的常見現(xiàn)象，而肽一般是先環(huán)化再純化，如果其中的色氨酸發(fā)生了氧化作用，肽在HPLC柱上的滯留時(shí)間會(huì)發(fā)生變化，氧化可以通過(guò)純化去除。再者，氧化的肽也可以通過(guò)MS檢測(cè)到。 Q：如何確定肽已成環(huán)？ A ：我們用Ellman反應(yīng)來(lái)檢測(cè)成環(huán)反應(yīng)是否完全。如果Ellman檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（黃色），說(shuō)明成環(huán)反應(yīng)不完全；如果檢測(cè)結(jié)果為陰性（不是黃色），說(shuō)明成環(huán)反應(yīng)已進(jìn)行完全。在氧化前和氧化后，我們將可以提供客戶質(zhì)譜分析圖譜，已確認(rèn)是否已氧化；我們對(duì)客戶不提供環(huán)化鑒定的分析報(bào)告，一般在QC報(bào)告單中會(huì)有關(guān)于Ellman檢測(cè)結(jié)果的描述。 Q：含有Cys的多肽在出貨前經(jīng)過(guò)還原了嗎？ A ：如果沒有發(fā)現(xiàn)肽已經(jīng)被氧化，我們一般不對(duì)Cys 進(jìn)行還原。所有的多肽都是由粗品在pH2條件下純化、凍干后得到的，這樣的pH條件至少在某種程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般在pH2條件下進(jìn)行純化，除非有特殊原因需要在pH6.8條件下純化。如果純化在pH6.8進(jìn)行，純化產(chǎn)物必須馬上用酸處理以防氧化。在最后的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，對(duì)于含有Cys的肽，如果MS 圖譜上發(fā)現(xiàn)有分子量為(2P+H)的物質(zhì)存在，說(shuō)明已形成二聚體。如果MS和HPLC都沒有問題，我們就直接凍干后出貨，無(wú)須再做任何處理。需要指明的是，含有Cys的肽隨著時(shí)間的推移會(huì)發(fā)生緩慢的氧化，氧化程度主要取決于肽序列及貯存條件。 轉(zhuǎn)載于www.rdpeptide.com |
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zgyghq
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將熊
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