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cyz20050505木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】問個有關(guān)熒光定量的棘手問題，來了好幾個技術(shù)支持都找不出原因。
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1.儀器：ABI7300實時定量PCR系統(tǒng) 2.前提條件：儀器各種的驗證程序，驗證板反應(yīng)均為正常。在其上做絕對定量反應(yīng)均為正常 3.問題來了：我首先用用普通PCR和瓊脂糖電泳驗證了有擴增且條帶非常單一，無引物二聚體，拖尾，拖帶，等一些不和諧現(xiàn)象，于是我就上7300，程序與參數(shù)設(shè)置也是正確的，這是發(fā)現(xiàn)在有ROX參比熒光的條件下，擴增曲線在進入對數(shù)增長期就斷了，去掉ROX，則是正常曲線，于是我單獨分析ROX，發(fā)現(xiàn)在擴增進入對數(shù)增長期時，ROX的信號掉到了0以下，所以導致曲線中斷，但是消除ROX后，孔間重復性非常差，顯然誤差是極大的。于是乎我又更換了TaKaRa，TIANGEN，ABI，BioRad的熒光試劑，結(jié)果都是如此，讓我悲劇了很長很長很長的時間，在不的已的情況，我去其他地方換7500做，同樣的樣品和試劑，就一點問題沒有，ROX的信號一直很穩(wěn)定，擴增曲線非常漂亮，孔間誤差極小。 4.所以我懷疑：檢測ROX的部件有問題?軟件算法有問題？還是機器其他地方有問題，沒有檢測到？對于上述問題，所謂的大工程師們給不了我一個明確有用的答復，只知道做標準板，標準板是加了Taqman探針的絕對定量，是沒有問題，但我們只做SYBRGreen，就是死活不行。此時此刻，又勾起了我傷心的記憶，因為我馬上又不的不背起一大堆東西去別的地方做實驗。 5.請大家支招，謝謝�。∠麓挝野褕D片傳上來，大家分析分析。 |
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