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竹林江南

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[交流] 【求助/交流】菌落PCR問(wèn)題

問(wèn)一下，我想構(gòu)建16s rRNA基因文庫(kù)。DNA提取、PCR擴(kuò)增（引物27f，1492r，產(chǎn)生片段約1500bp）純化都沒(méi)有問(wèn)題，連接載體pMDT19，連接后轉(zhuǎn)化、涂布平板有單克隆出來(lái)，但做菌落PCR時(shí)最多只有200bp的結(jié)果出來(lái)，是什么原因呢？
構(gòu)建另外一個(gè)目的基因克隆文庫(kù)，同樣的操作步驟，只是另外一對(duì)引物擴(kuò)增出的是500bp產(chǎn)物，克隆后菌落pcr能夠成功。

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1樓 2011-01-18 15:57:23

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猶寒

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竹林江南(金幣+1): 2011-01-19 13:45:05

引用回帖:

Originally posted by 竹林江南 at 2011-01-18 15:57:23:
問(wèn)一下，我想構(gòu)建16s rRNA基因文庫(kù)。DNA提取、PCR擴(kuò)增（引物27f，1492r，產(chǎn)生片段約1500bp）純化都沒(méi)有問(wèn)題，連接載體pMDT19，連接后轉(zhuǎn)化、涂布平板有單克隆出來(lái)，但做菌落PCR時(shí)最多只有200bp的結(jié)果出來(lái)，是什么原 ...

我的也出現(xiàn)問(wèn)題了，克隆出來(lái)，也pcr出來(lái)了條帶，只是測(cè)不出序，很是郁悶。另外，引物27f，和1492r是什么引物，通用引物嗎？主要p什么菌的？你的菌落PCR是怎么做的呢？有沒(méi)有非特異性條帶出現(xiàn)呢？

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2樓2011-01-19 10:20:15

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你的菌落PCR的引物是什么呢？

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3樓2011-01-23 17:41:18

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zgb1982

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4樓2011-01-23 18:35:39

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ureyguo

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竹林江南(金幣+2): 2011-08-18 10:20:12

連接效率的問(wèn)題，換換連接體系條件試試。

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5樓2011-03-03 17:26:43

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kingleo99

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竹林江南(金幣+3): 2011-08-18 10:20:40

你的菌落PCR幾乎都是假陽(yáng)性片段，建議可以使用上下游引物P47和P48，擴(kuò)增出的是1700bp 包括載體上的200bp。載體自連接估計(jì)在200左右。要么是你的連接效率太低，如果是這樣那最好別篩了重新轉(zhuǎn)化吧

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6樓2011-03-03 18:10:57

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yixuanwin

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竹林江南(金幣+2): 2011-08-18 10:21:07

200多是載體自連。說(shuō)明轉(zhuǎn)化效率低。換載體

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7樓2011-03-03 19:55:13

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shicaozhu

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

T載很少有自連的，可能是16S片段不純，建議PCR產(chǎn)物切膠回收后再連T載。

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8樓2012-04-07 13:38:07

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