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【求助】 關(guān)于原核表達(dá)【有效日期截止：2011年2月28日】
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我誘導(dǎo)表達(dá)了一個(gè)38KD左右的可溶性蛋白，使用pCold1-4作為表達(dá)載體，以BL21(DE3)作為宿主�，F(xiàn)存在以下問題，敬請(qǐng)各位大俠幫助！ 1.按照說明書，我在OD600=0.6-0.8時(shí)加入IPTG，15℃誘導(dǎo)過夜。誘導(dǎo)條件已經(jīng)過優(yōu)化，IPTG濃度1mM，15℃誘導(dǎo)24小時(shí)為最佳。以空載體作為對(duì)照，誘導(dǎo)過夜后，SDS-PAGE電泳后，無目的蛋白出現(xiàn)，并且和對(duì)照沒有什么區(qū)別。但是拿得到的蛋白做活性分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)有活性，Why? 2.目的蛋白的等電點(diǎn)為7.34，所用的buffer是Tris-HCl (pH 7.5) ,是否會(huì)造成在E.Coli細(xì)胞破碎過程中目的蛋白的沉淀？ 3.若是用帶有His-tag的pCold2，純化采用的是His TALON Gravity Columns Purification Kit，該試劑盒中的所有buffer的pH都是7.34。問題是蛋白不掛柱，在上樣之后立馬掉下來，是否和buffer的pH值有關(guān)？ 4.若是組氨酸標(biāo)簽被包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，該如何純化，在哪步加入8M的尿素？ [ Last edited by swallow2007 on 2011-2-8 at 12:41 ] |
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wjwang123
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3樓2011-02-08 16:37:20
AZURESKY1999
至尊木蟲 (知名作家)
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★
swallow2007(金幣+1):謝謝參與
swallow2007(金幣+44): 謝謝啊，我也想到了這一點(diǎn)兒，將緩沖液的pH調(diào)整到8.0，依然和對(duì)照沒什么區(qū)別，下一步打算用8M的尿素，謝謝你！ 2011-02-09 08:45:09
swallow2007(金幣+1):謝謝參與
swallow2007(金幣+44): 謝謝啊，我也想到了這一點(diǎn)兒，將緩沖液的pH調(diào)整到8.0，依然和對(duì)照沒什么區(qū)別，下一步打算用8M的尿素，謝謝你！ 2011-02-09 08:45:09
| 如果樓主表達(dá)的是可溶性蛋白，一般而言，所需要的目的蛋白在溶液中，由于目的蛋白的等電點(diǎn)在7.34左右，建議所用的緩沖液的PH值要遠(yuǎn)離該等電點(diǎn)，即用PH7.5的緩沖液不好，可以考慮PH6.5左右或8.0以上，不然目的蛋白在PH7.5時(shí)容易沉淀，會(huì)導(dǎo)致目的蛋白沉淀從而損失較多的目的蛋白，對(duì)以后的純化造成困難，如果用親和層析純化，一開始也可以用8M尿素溶解蛋白的，也可以考慮其它純化方式，如離子交換，疏水層析等 |
4樓2011-02-08 16:43:25
魔男小崔
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簡(jiǎn)單回復(fù)
xyfei2樓
2011-02-08 15:12
回復(fù)
swallow2007(金幣+1):謝謝參與
swallow2007(金幣+1, 博學(xué)EPI+1): 2011-02-09 08:42:20
YUE-jf(博學(xué)EPI-1): 無效 2011-04-06 11:36:38
swallow2007(金幣+1, 博學(xué)EPI+1): 2011-02-09 08:42:20
YUE-jf(博學(xué)EPI-1): 無效 2011-04-06 11:36:38
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