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比較詳細的PCR
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1.PCR反應(yīng)的最適條件 4．1 TaqDNA聚合酶 在早期進行的PCR反應(yīng)中，使用的是大腸桿菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌體T4 DNA聚合酶。這兩種酶的共同弱點是對熱不穩(wěn)定性，DNA合成反應(yīng)只能在370C進行。PCR時每一循環(huán)的解鏈溫度都在90C以上進行，故在每兩個循環(huán)之間要加入新的DNA聚合酶，使得整過程整個實驗過程很繁瑣和昂貴。同時在370C，引物與DNA模板之間會發(fā)生分子非特異性結(jié)合，最終導致很多非特異性DNA片段的擴增。 Taq 酶有耐高溫的特性，其最適的活性溫度是720C（75-80），連續(xù)保溫30分鐘仍具有相當?shù)幕钚裕以诒容^寬的溫度范圍內(nèi)都保持著催化DNA合成的能力，一次加酶即可滿足PCR操作過程自動化的實現(xiàn)。 （1） TaqDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性及最適延伸溫度 相對分子質(zhì)量為94000的TaqDNA聚合酶的酶活性較高，大約為200000Umg，在合成時有一個較高的最適溫度75-80C，轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat接近150nt/(s•酶分子)。這種活性有明顯的溫度依賴性。TaqDNA聚合酶雖然在90C以上合成DNA的能力有限，但高溫時仍比較穩(wěn)定。有人試驗證明在92.5C,95C,和97.5C時，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經(jīng)130分鐘、40分鐘和5-6分鐘后仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長。所以，在一個PCR預備試驗中，每次循環(huán)時上限溫度為95C（試管內(nèi)）處理20秒，則循環(huán)50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實驗的需要。 TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最適延伸溫度在75-80C時，dNTP的摻入速度為35-100nt/(•酶分子),最長延伸長度7。6kb，如對M13上的富含GC的30-me引物，該酶在70C的延伸率高于60nt/(•酶分子), 在55C仍有較高的延伸活性，22C和37C時延伸速度分別為0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可見，在低溫下，TaqDNA聚合酶一表現(xiàn)活性明顯降低，因而，導致此酶在模板鏈分子內(nèi)局部二級結(jié)構(gòu)區(qū)域的延伸能力受損或前進速率常數(shù)與解離常數(shù)的比值發(fā)生改變。在很高的溫度（90C以上）時，很少DNA合成。在體外條件下，DNA在較高溫度時的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的限制。溫度對TaqDNA聚合酶活性的影響見表。 由于TaqDNA聚合酶的最適延伸溫度高達75-80C，故退火和延伸反應(yīng)溫度均可提高，限制了非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)，增加了PCR的特異性。 4．2 模板 （1） 模板的純度 一般不要求很高，不需要達到超純。某些擴增實驗中甚至可以直接將溶細胞液煮沸加熱，用蛋白質(zhì)變性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影響擴增反應(yīng)的物質(zhì)存在，例如蛋白酶、核酸酶、結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等；另一類是尿素、十二烷基硫酸鈉、卟啉類物質(zhì)等；還有一類是二價金屬離子的絡(luò)合劑（如EDTA）等，會與Mg2+絡(luò)合，影響Taq DNA聚合酶的活性。上述物質(zhì)的存在會影響擴增效果，甚至使擴增失敗。 （2） 模板DNA的量 一般對于單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100ul的反應(yīng)體系中有100ng的模板已足夠。有時，加的模板太多，會令擴增失敗。這時如果對模板稀釋后再加入反應(yīng)體系中，往往能獲得成功。 4．3 dNTP dNTP儲備液必須為PH7.0左右,濃度一般為2mmol/L, 分裝后置-20C保存.典型的PCR擴增體系中,兩種dNTP的終濃度為20-200umol/L. 理論上,100ul反應(yīng)液中兩種dNTP的濃度為20umol/L時,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. DNTP會絡(luò)合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP會增加Taq DNA聚合酶的錯配率.如果dNTP的濃度達到1mmol/L時,則會抑制Taq DNA聚合酶活性. 4．4 Mg2+濃度 Taq DNA聚合酶在合成新DNA鏈時,要求有游離的Mg2+,因而在PCR系統(tǒng)中確定Mg2+的最適濃度是必要的. Mg2+濃度太低會無PCR產(chǎn)物,太高又會導致非特異的產(chǎn)物產(chǎn)生. 故常需根據(jù)各自的實驗預先試驗,以確定本實驗的最佳Mg2+濃度,保證DNA聚合酶具有良好的活性. 通常情況下,要求反應(yīng)體系中有0.5-2.5mmol/L的游離Mg2+.反應(yīng)內(nèi)容物中, dNTP能與Mg2+.結(jié)合,所含EDTA會與Mg2+絡(luò)合,高濃度的DNA也有干擾作用,都會影響Mg2+的有效濃度. 4．5 PCR系統(tǒng)中的其它成分 PCR反應(yīng)緩沖溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是兩性離子緩沖劑.此外,還有50 mmol/L KCL, 它有利于引物與模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl對Taq DNA聚合酶有抵制作用.明膠或血清白蛋白(100ug/ml)及非離子去污劑,如Tween20等,對Taq DNA聚合酶起穩(wěn)定作用. 4．6 PCR的熱循環(huán)計劃 在標準反應(yīng)中,將標本加熱至90-95C,使DNA雙鏈變性, 再快速冷卻至40-60C使引物退火并結(jié)合到互補靶序列上,然后升溫至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下?lián)饺雴魏塑账崾挂镅啬０逖由?每步時間從反應(yīng)達到要求溫度后計算. PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性\引物退火和反應(yīng)延伸3個步驟組成的.圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94C變性1分鐘,60C退火1分鐘,72C延伸1.5分鐘.如此周而復始,重復進行,直到擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止. (1) 變性溫度與時間 使靶基因模板和PCR產(chǎn)物完全變性是PCR成敗的關(guān)鍵.DNA在其鏈分解溫度時的變性只需幾秒鐘,但反應(yīng)管內(nèi)達到Tss還需一定時間,變性溫度太高會影響酶活性;通常情況下94-95C變性1分鐘就足以使模板DNA完全變性,更高的溫度可能更為有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低于94C,則需延長變性時間.為提高起始模板的變性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先變性7-10分鐘,再按94C的變性溫度進入循環(huán)方式,這對PCR的成功有益處. (2) 復性溫度與時間 復性溫度決定著PCR的特異性.引物復性所需的溫度與時間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。合適的復性溫度應(yīng)低于擴增引物在PCR條件下真實Tm值的5C，引物越短（12-15bp）,復性溫度越低（40-45C）。一般來說，若降低復性溫度（37C），可提高墳增產(chǎn)量，但引物與模板間錯配現(xiàn)象會增多，導致非特異性擴增上升；若提高復性溫度（56-70C），雖擴增反應(yīng)的特異性增加，但擴增效果下降。理想的方法是：設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定擴增反應(yīng)的最適復性溫度。 （3）延伸溫度與時間 Taq DNA聚合酶雖能在較寬的溫度范圍內(nèi)催化DNA的合成，但不合適的溫度仍可對擴增產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量造成影響。引物延伸溫度一般為72C（較復性溫度高10C左右），延伸時間視目標DNA片段長短和濃度而定。在最適溫度下，核苷酸的摻入率為35-100nt/s，這也取決于緩沖體系、PH值、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)等，延伸1分鐘對長達2kb的擴增片段是足夠的，延伸時間過長會導致非特異擴增帶的出現(xiàn)，但在循環(huán)的最后一步延伸時，為使反應(yīng)完全，提高產(chǎn)量，可將延伸時間延長4-10分鐘。 （4）循環(huán)數(shù) 循環(huán)數(shù)決定著擴增程度，常規(guī)PCR一般為25-40周期，在其他參數(shù)交已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度，其相應(yīng)關(guān)系參照下表 模板DNA分子數(shù) 需要熱循環(huán)次數(shù) 3．0×105 25-30 1．5×104 30-35 1．0×103 35-40 50 40-45 循環(huán)次數(shù)太少，得不到一定的產(chǎn)物量；循環(huán)次數(shù)太多時，擴增反應(yīng)的后期，產(chǎn)物積累的指數(shù)率下降甚至不再有正確的產(chǎn)物生成，正常的反應(yīng)幾乎停止，呈現(xiàn)平臺效應(yīng)。 影響出現(xiàn)平臺效應(yīng)的因素有： A、反應(yīng)試劑（dNTP或酶）穩(wěn)定性的改變； B、終產(chǎn)物（如焦磷酸）的抑制效應(yīng)； C、產(chǎn)物濃度超過10-5時可產(chǎn)生重復退火，于是會降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性 D、高濃度產(chǎn)物DNA雙鏈的解鏈不寶劍。平臺效應(yīng)時的一種重要后果是由于錯誤引導，在開始時濃度不高的非特異產(chǎn)物會繼續(xù)擴增，使結(jié)果的分析復雜化。 4．3引物的要求： （1） 一般長15-30bp，常用20bp（理論上420=11×1011長的DNA片段才會有重復）。引物過長，擴增的效率降低。 （2） 堿基組成：C+G占50-60%（常規(guī)），盡量避免數(shù)個嘌呤和嘧啶的連續(xù)排列。 （3） 一對引物之間不能有2個以上的堿基互補，特別是3‘末端；引物之間的堿基互補會形成引物二聚體，引物本身應(yīng)避免回文序列。 （4） 引物與模板退火的溫度和所需的時間取決于引物的堿基組成、長度和溶液中引物的濃度。合適的退火溫度是低于引物本身的實際變性溫度（Tm）50C。20bp左右長度的DNA片段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火溫度通常在55-720C下進行在標準的引物濃度（0.2umol/L）下，幾秒內(nèi)即可完成退火。提高退火溫度可提高引物與模板結(jié)合的特異性。特別在最初幾次循環(huán)中采用嚴謹?shù)耐嘶饻囟�，有助于PCR特異性擴增。如果引物中（G+C）的含量小于50%，退火溫度應(yīng)低于550C。 （5） 100ul的PCR反應(yīng)液中，引物的絕對量為10-100pmol。PCR反應(yīng)液中2個引物濃度不等時，其濃度比為50:1，稱為不對稱PCR。 簡并引物：由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數(shù)個核苷酸的差異。若PCR擴增引物的核苷酸組成順序是根據(jù)氨基酸順序推測而來，就需合成簡并引物。 嵌套引物：利用第一輪PCR擴增產(chǎn)物作為第二輪PCR擴增的起始材料，同時除使用第一輪的一對特異引物外，另加1-2個新引物（處在同一個模板DNA的頭兩個引物之間序列）進行第二輪擴增。通過嵌套引物擴增的產(chǎn)物，產(chǎn)生錯誤擴增的可能性極小，所以應(yīng)用嵌套引物技術(shù)能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增。 PCR的的應(yīng)用：基因克隆、反向PCR、不對稱PCR、RT-PCR、基因的體外誘變和突變檢測、基因組的比較研究。 典型的PCR操作：（見資料一） 2. 細菌標本處理：裂解細菌的方法包括加熱（950C）、反復凍融和化學試劑裂解。細菌濃度只要不超過100個/ul，裂解后可直接用于PCR. 3. 細菌DNA的提取： （1） 試劑：主要包括10mmol/LTris-Hcl(pH8.0)、10%SDS、3mol/L醋酸鈉（pH5.2）、Rnase液（10mg/ml）、冷乙醇和70%乙醇。 （2） 方法 A、 從平板上挑取1.5mm的菌落移到預先裝有50ul 10mmol/LTris-Hcl液的微量離心管中,使之懸起. B、 加50ul 10%SDS液 ,600C充分混勻,作用10min. C、 加入250ul 10mmol/Ltris-Hcl液;60ul 3mol/L的醋酸鈉和10ul RNase液混勻,370C作用10min. D、 加入1ml冷乙醇,混勻后可見DNA沉淀. E、 取出DNA沉淀球,置另一潔凈離心管中,加入500ul 10mmol/LTris-Hcl溶解DNA F、 加入1ml乙醇高氯酸鹽試劑,置40C 1h. G、 于40C,12000r/min離心10分鐘,傾去上清,用70%的乙醇洗沉淀一次.涼干后溶于20ulTris-Hcl液,PCR中用10-20ul. 若制備革蘭氏陽性菌DNA標本,可于第一步中加入10ul葡萄球菌溶素(0.5mg/ml,用蒸餾水配制)370C作用15分鐘后,再按上述B-G步操作. 4. 病毒標本DNA的提�。�(參見預防獸醫(yī)實驗，PCR技術(shù)) （1） 將5ml組織培養(yǎng)液上清或血清500×g離心5分鐘去除細胞。 （2） 取上清再以10000×g離心10分鐘，去除大顆粒物質(zhì)。 （3） 小心吸取上清，以SW50.1轉(zhuǎn)頭50000r/min離心45分鐘沉淀病毒顆粒，用PBS液平衡離心管。 （4） 去上清，用100-500ul鉀緩沖液（含50mmol/L KCl、10-20 mmol/LTris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2(pH8.3)、1%laureth12(一種表面活性劑)、0.5%Tween20、100ug/ml蛋白酶K）的TE緩沖溶液溶解病毒顆粒。 （5） 將溶解的病毒顆粒轉(zhuǎn)移到另一潔凈微量離心管中，并在550C保溫30-60分鐘。然后，950C加熱滅活蛋白酶，冷卻樣品并離心除去所有碎片。 （6） 在100ul PCR反應(yīng)液中，加5-10ul病毒核酸液。RNA病毒可用5-10ul進行cDNA合成。 二、 4．PCR操作 4．1 試劑： （1） 引物：根據(jù)待擴增DNA不同，引物亦不同。 （2） TaqDNA聚合酶：能耐受93-100C的高溫。 （3） 10*PCR緩沖液：含500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl(pH8.4, 20C)、150mmol/L MgCl及1mg/ml明膠。 （4） 5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP、dTTP鈉鹽各100mg合并，加3ml滅菌無離子水溶解，用NaOH調(diào)pH值至中性，分裝每份300ul，-20C保存。DNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。 （5） 標本處理試劑： 4.2 操作程序： (1) 向一微量離心管中集資加入如下物質(zhì)： 10*PCR緩沖液 1/10體積 DNA模板 10-10拷貝 dNTP 各200umol/L ddHO補至終體積（終體積50-100ul）引物（一對人工合成寡核苷酸）各1umol/L 混勻后，離心15秒使反應(yīng)成分集于管底。 (2) 加石蠟50-100ul于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97C變性7分鐘（染色體DNA）或5分鐘（質(zhì)粒DNA）。 (3) 冷至延伸溫度時，加入1-5uTaqDNA聚合酶，在此溫度下作用1分鐘。 (4) 于變性溫度下（92-93）使模板DNA變性45秒。 (5) 在復性溫度下（55C）使引物與模板雜交45秒。 (6) 在延伸溫度下（72C）使復性的引物延伸1分鐘。 (7) 重復（4）-（6）步25-30次，每次即為一個PCR循環(huán)。 (8) 微量瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物。 3. PCR的結(jié)果分析 （2） 瓊脂糖凝膠電泳 （3） 限制性內(nèi)切酶片段分析 用限制性內(nèi)切酶酶解PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)有特定的限制性內(nèi)切酶片段，則說明擴增的PCR產(chǎn)物是特異的，反之表明PCR產(chǎn)物在限制性位點發(fā)生了堿基突變。 （4） 核酸雜交 首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。陽性表明PCR產(chǎn)物是特異的。 |
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