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【求助】Sephadex LH-20溶脹用什么溶劑
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xiaodu2007693(金幣+3): 謝謝 這么晚才獎勵，辛苦了 2011-07-10 14:06:59
xiaodu2007693(金幣+3): 謝謝 這么晚才獎勵，辛苦了 2011-07-10 14:06:59
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【轉載】Sephadex LH-20的使用心得 http://www.wingene.net/bbs/viewthread.php?tid=80轉自以上帖子，下面是帖子的內容，我復制下來的，如果覺得有點亂，可以打開上面的鏈接阿。 Sephadex LH20使用心得談： 1 Sephadex LH20是一種價錢較高的填料，使用請千萬注意，很貴的喲�。ó斎�，老板有錢就另當別論拉） 2 先講Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。 3 再講Sephadex LH20 洗脫溶劑。聽我講完 第2點后，其實就應該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇－－水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿－－甲醇最為常見，先用50％氯仿－－甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。 4 接下來講樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇－－水），樣品用最少體積的甲醇－－水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿－－甲醇），樣品用最少體積的氯仿－－甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。 5 分離的技巧，最后說說我的使用心得 （1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。 （2）柱子盡可能長， Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢兵力，打擊敵人。 （3） 餾分一定要接的細，可1／10，或1／20 個保留體積接成一餾分。 （4） 洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積。 （5）鞣質成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質 （6）Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻參考。 （7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用 問：在不同的溶劑中的吸漲程度是不是不同?那進行梯度洗脫會不會有影響.還有是不是樣品的溶解是不是要與洗脫的起使?jié)舛认嗤?如何確定樣品在最佳配比的容液中溶呢?還有分到什么程度是用Sephadex LH20比較好? 解答如下: 1 "在不同的溶劑中的吸漲程度是不是不同?那進行梯度洗脫會不會有影響." 當然有影響,Sephadex LH20在不同的溶劑中的吸漲程度是不同的(任何填料都是這樣,只是Sephadex LH20很明顯),一般在丙酮，乙酸乙酯 中收縮很厲害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶劑,如果前后使用的兩種洗脫溶劑對Sephadex LH20的吸漲程度相差很大,還會產(chǎn)生大量氣泡.以下列舉了1g干態(tài)的,Sephadex LH20對不同溶劑中的保留體積： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml 2 "還有是不是樣品的溶解是不是要與洗脫的起使?jié)舛认嗤?如何確定樣品在最佳配比的容液中溶呢?" 樣品的溶解最好與洗脫的起使?jié)舛认嗤�，但有時（其實是多數(shù)情況下），都辦不到。對Sephadex LH20上樣樣品的要求是 1 樣品一定要溶解（Sephadex LH20很貴，要保護填料，我看植化的同志對好填料看得都很重，職業(yè)問題，哈哈哈；同時，避免樣品不溶解造成的脫尾） 2 溶解樣品的體積盡可能�。ㄉV分離理論的基本要求，減小原始譜帶寬度） 3 樣品的溶解最好與洗脫的起使?jié)舛认嗤ㄈ魳悠返娜芙馊軇┍认疵摰钠鹗節(jié)舛认疵撃芰�，則會人為增加洗脫起使溶劑的洗脫能力；同時若樣品的溶解溶劑與洗脫的起使溶劑差別很大，樣品可能以為溶解性的問題而析出。） 以上三點是上樣的基本要求，有時很難求全，只有根據(jù)具體的實際來決定了。一般我的做法是滿足1，2點，盡量滿足第三點，“如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇－－水），樣品用最少體積的甲醇－－水（盡可能甲醇少一些）溶解”，請注意我的陳述“盡可能”， 3 "還有分到什么程度是用Sephadex LH20比較好?" 如果實驗室Sephadex LH20很珍貴，分道較純再用， 如果實驗室Sephadex LH20很普及，只要滿足使用的注意事項，較粗的樣品可直接使用Sephadex LH20分離。日本的師兄都是用Sephadex LH20粗分，人家有錢，所以不在乎。如果硅膠比Sephadex LH20還貴，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅膠吧。有很多問題根本不是學術本身的問題，人也不可能在真空中搞科研。哈哈，跑題了。 問：那上樣體積與柱體積最小的比是多少？我用100克的填料，如果樣品不好溶，那一次最多能上多少毫升的樣呢？ 1 在分離過程中遇到要分離的樣品量很大,而柱層填料相對較少的情況是很多的.一般解決的途徑有兩條: 1） 將樣品一次全上柱,這樣分離效果一定不會好,但我們的側略是將樣品交疊的部分再上一遍或幾遍,這叫反復xxxx柱層，好處是工作量�。▽Ρ认旅婢椭懒耍�，在前后較純的餾分，如果目標組分量足夠，可就樂去吧。 2 ） 將樣品分幾次分別分離，這樣每次分離的效果一定比將樣品一次全上柱的分離效果好，但這樣有一個很大的弊病，就是每次柱層的條件不可能保持完全一至，這樣幾次柱層分離的餾分間的重現(xiàn)性就存在很大問題，再將幾個分開上的柱層餾分合并的過程中，合的太粗，就如同 將樣品一次全上柱的合并結果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的餾分，我也不知怎么合并了。 所以推薦的做法是將樣品一次全上柱，再通過反復柱層的方法來逐步提高分離效果， 唉呀，我嘴苯，不知有沒有說清。 2 100g填料已不少了， astra兄的樣品如果實在太多，就只好分開上柱了. 3 一般Sephadex LH20上樣體積具體也沒有明確的規(guī)定，在柱床體積的1／10吧。 問：分得效果不是很好，上了有8毫升的樣，我用甲醇洗脫，結果用約一個保留體積就洗完了，東西不僅越分越少，而且仍然和沒上柱之前差不多，很讓人困惑，郁悶。 不要著急,實驗是一點一點做出來的,剛開始總是困難的.首先我要說的是Sephadex LH20不是萬能的,你的樣品不一定適于用它分離, 1 "結果用約一個保留體積就洗完了",這很正常,這也是Sephadex LH20這種填料的特點:"洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積", 2 "我用甲醇洗脫,而且仍然和沒上柱之前差不多",說明你的樣品組分之間分子大小差別不大,所以Sephadex LH20的凝膠過濾作用不起作用了,如果你還用Sephadex LH20分離,那你應該利用他反相分配的作用,即先用低濃度的甲醇/水,逐漸提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脫. 1 A君提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脫，但洗出的流份比較難處理,是指甲醇水難蒸干嗎?其實這根本不應成為問題.astra君請想一想,做植化的,哪有遇不到甲醇水的時候, ODS柱層用甲醇水洗脫, Sephadex LH20柱層用甲醇水洗脫,D101用乙醇水洗脫, HP20 用甲醇水洗脫, 高效液相最常用的是反相, 流動相還是甲醇水,可見甲醇水是植化同志最親密的朋友! 所以蒸不干也要蒸,想想辦法嗎! 2 .像水這種高沸點的溶劑是很難蒸干的,,辦法是有的,先看看旋轉薄膜的幾個要素: 真空度, 冷凝液, 蒸發(fā)溫度. 1) 真空度決定于水泵的效率和系統(tǒng)的密閉性.一般的國產(chǎn)水泵就能滿足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循環(huán)水一定要開,如果不開循環(huán)水,水泵中的水很快就會變得很熱,將極大地減少水泵的效率,且會將抽出的溶劑揮散出來,很不好! 比國產(chǎn)水泵更好的是進口水泵,比進口水泵更好的是隔膜泵,系統(tǒng)的密閉性就更重要了,特別是蒸像水,丁醇這樣的溶劑,對系統(tǒng)的密閉性的要求很高,對于系統(tǒng)密閉性不好時,可采用逐步拆分法來查漏,最容易出問題的地方在墊圈,國產(chǎn)的旋轉薄膜配的墊圈很爛,全不耐氯仿等有機溶劑,當用國產(chǎn)的旋轉薄膜蒸過氯仿等有機溶劑,墊圈就廢了.所以要多預備幾個墊圈. 2) 冷凝液一般使用水,如果配一臺冷阱,使用半量的水配比上辦量的汽車冷凍液, 效果棒極了 3) 提高蒸發(fā)溫度當然可以提高蒸發(fā)的效率,但可能發(fā)生物質的變化,國產(chǎn)旋轉薄膜,水泵,用水冷,當然就只好提高蒸發(fā)溫度了 我用東京理化的旋轉薄膜,1/2汽車冷凍液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽! 3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度將大大提高! Sephadex LH20柱子被弄臟了，大多數(shù)情況下是由于樣品沒濾, 將柱頭堵住,或由于樣品的死吸附(一般很少發(fā)生),使柱子的柱頭部分污染,一般的處理是將被污染的柱頭部分的填料棄去,具體做法很簡單,只將被污染的柱頭部分的填料用玻棒輕輕攪起,倒掉即可, 2 如果柱子整個被污染,如果是將Sephadex LH20用反相被污染，辦法如下 依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗滌被污染的柱子。因為是整個柱子被污染，所以污染物一定不會完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定會只在柱頭部分），所以用合適的溶劑一定可以將之洗下來。 NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水 看了上面戰(zhàn)友們的討論，感覺受益菲淺。小弟也來班門弄斧，發(fā)言不對之處，請各位兄臺指正： Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，Sephadex G-25羥丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子篩作用，在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高，但由性能頗佳，可再生利用，所以倍受欽睞。此外上柱樣品損失很少，對處理小樣品較好，這也是我們實驗室常用的原因之一。 我用Sephadex LH-20的步驟是： 1.選擇條件： 梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。 2.飽和層析柱： 用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。 3.樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。 4.濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。 5.洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù);必要時更改極性（很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢）。 6.再生以備下次使用。 問：不知道用反響柱分離合用LH-20那個效果比較好.同時如果用同一根LH-20的話,洗脫劑可以從氯仿-甲醇換到甲醇-水嗎?還有一個問題,上LH-20的時候可以用一個梯度洗脫吧?最后用甲醇沖柱就可以了吧?? 1.Sephadex LH-20主要還是分子篩的作用機理，在非極性溶劑中有一定的反相柱效果。如要分離的物質在反相板上分離效果好，那么大可在反相柱中進行分離;如果要分離的物質分子量相差較大，當然是Sephadex LH-20效果好。實際使用中往往上在一起配合使用，逐漸細分為多個部分直到拿到純品。 2.Sephadex使用時一般不進行梯度洗脫（洗柱的時候當然要換）。如果改變流動相的極性，會改變凝膠的膨脹率，分量不同的物質在網(wǎng)孔改變過程中引起交錯，反而達不到分離效果。如果要分離的樣品中極性相差較大，可以細分為不同的極性段再上Sephadex LH-20 我們實驗室用的LH-20柱一般就是甲醇：二氯甲烷（1：1）作流動相，如果沖不干凈就換純甲醇來沖，沒碰到過你說的情況！根據(jù)LH-20在不同溶劑中的溶漲程度不同，如果你用的溶劑溶漲系數(shù)接近的話，可能影響不大，如果溶劑之間溶漲系數(shù)相差較大，我想出現(xiàn)氣泡是可能的。（借用前面同學提供的數(shù)據(jù)） 以下列舉了1g干態(tài)的,Sephadex LH20對不同溶劑中的保留體積： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml 丙酮 0.8ml |
5樓2011-03-14 14:49:37
3樓2011-03-14 13:37:37
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喜洋洋1024(金幣+1):謝謝參與
xiaodu2007693(金幣+2): 謝謝 2011-07-10 14:06:44
喜洋洋1024(金幣+1):謝謝參與
xiaodu2007693(金幣+2): 謝謝 2011-07-10 14:06:44
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Sephadex LH20簡介 Sephadex LH20是一種價錢較高的填料，特點： 1、適合用有機溶劑分離嗜脂性分子，可以非常經(jīng)濟地大規(guī)模制備各種天然產(chǎn)物 2、結合凝膠過濾、分配色譜及吸附性層析于一身，分離結構非常相近的分子 3、載量可高達300mg樣品/ml凝膠，極少需要再生，分離效果可保持十幾年不變。 編輯本段Sephadex LH20 的原理 Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。 編輯本段Sephadex LH20 洗脫溶劑 Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇－－水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿－－甲醇最為常見，先用50％氯仿－－甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。 編輯本段樣品的處理和洗脫溶劑的選擇 如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇－－水），樣品用最少體積的甲醇－－水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿－－甲醇），樣品用最少體積的氯仿－－甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。 編輯本段分離的技巧 �。�1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。 �。�2）柱子盡可能長， Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢兵力，打擊敵人。 �。�3） 餾分一定要接的細，可1／10，或1／20 個保留體積接成一餾分。 �。�4） 洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積。 （5）鞣質成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質 �。�6）Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻參考。 （7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。 |
4樓2011-03-14 14:44:36
6樓2013-06-03 20:42:19
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