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生興生物銀蟲 (小有名氣)
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【分享】核酸雜交(Southern blot和Nouthern blot)疑惑解析------送給新手們的禮物 已有3人參與
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 對(duì)于剛開始做實(shí)驗(yàn)的人來(lái)說(shuō)，收集資料比不可少，然而現(xiàn)在重復(fù)性資料很多很雜，要想在較短的時(shí)間內(nèi)獲得更過(guò)的信息，就必須找到高效的信息資源，我以下的內(nèi)容也是從各種渠道收集來(lái)的資料，我把它們做了整理，截取了其中比較有價(jià)值的內(nèi)容進(jìn)行編排，希望你看過(guò)之后能對(duì)核酸雜交有個(gè)全面的認(rèn)識(shí)，在做實(shí)驗(yàn)時(shí)少犯錯(cuò)誤。核酸雜交（Nucleicacid hybridization），又稱核酸分子雜交。 原理：是核酸變性和復(fù)性理論。雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開形成單鏈，當(dāng)理化因素消除后，具一定同源性的兩條（探針和待測(cè)核苷酸序列）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性形成雙鏈。核酸分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。 分類：核酸分子雜交按作用環(huán)境不同分為固相核酸分子雜交和液相核酸分子雜交。 一、固相核酸分子雜交 原理：將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。固相雜交時(shí)，未雜交的游離片段很容易漂洗除去，膜上的雜交物容易檢測(cè)并能防止靶DNA自我復(fù)性，故該方法最為常用。 常用類型：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Sou thern blot雜交、Northern blot雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 {:2_45:}基本操作步驟： 1、制備樣品：從待檢測(cè)組織樣品中提取DNA或RNA。DNA應(yīng)先用限制性內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的片段，然后通過(guò)凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進(jìn)行分離。再將含有DN***段的凝膠進(jìn)行變性處理后，直接轉(zhuǎn)印到支持膜上并使其牢固結(jié)合。這樣檢測(cè)片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉(zhuǎn)印膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉(zhuǎn)印并交聯(lián)固定。 2、制備探針：探針是指一段能和待檢測(cè)核酸分子依堿基配對(duì)原則而結(jié)合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探針需要被標(biāo)記上可直接檢測(cè)的元素或分子。這樣，通過(guò)檢測(cè)與轉(zhuǎn)印膜上的核酸分子結(jié)合的探針分子，就可知道被檢測(cè)的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。 3、雜交：在雜交前先進(jìn)行預(yù)雜交，封閉膜上非特異的DNA結(jié)合位點(diǎn)，以降低非特異性雜交。正式雜交時(shí)，由于轉(zhuǎn)印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以核酸雜交過(guò)程中只需變性標(biāo)記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應(yīng)，然后洗去未結(jié)合的探針分子即可。 4、檢測(cè)：檢測(cè)的方法依標(biāo)記探針的方法而異。用放射性同位素標(biāo)記的探針需要放射自顯影來(lái)檢測(cè)核酸片段在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標(biāo)記的探針則需要用相應(yīng)的免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)。 二、液相核酸分子雜交 液相核酸分子雜交，是一種研究最早且操作復(fù)雜的核酸雜交類型，在過(guò)去的30年里雖被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍，主要原因是雜交后過(guò)量的未雜交探針在溶液中除去較為困難，誤差也較高。 常用的兩種固相核酸分子雜交技術(shù) 1 .Southern Blot 原理：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。 用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。 2. Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。 用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 常見問(wèn)題 Q1：標(biāo)記方法有哪幾種？ A1：（1）切口平移法（2）隨機(jī)引物  法（3）末端標(biāo)記法（4）單鏈DNA探針標(biāo)記（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法Q2：探針標(biāo)記物的分類有幾種？ A2：（1）探針標(biāo)記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標(biāo)記敏感性高，可檢測(cè)pg水平的核酸，但因不易長(zhǎng)期保存，且存在放射性污染等問(wèn)題，現(xiàn)已較少應(yīng)用。 （2）非放射性物質(zhì)常用的有生物素、地高辛等，非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟(jì)，但敏感性較低，近年來(lái)，由于雜交信號(hào)檢測(cè)方法的改進(jìn)，檢測(cè)的敏感性得到了很大提高。 Q3：怎樣確定探針的濃度？ A3：總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜核酸分子雜交中放射性核素標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5-5.0 μg/ml。 Q4：如何選擇核酸分子雜交的最適溫度？ A4：核酸分子雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的核酸分子雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10-15 ℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30 ℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。最適復(fù)性溫度：Tor =Tm–25 ℃苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35 ℃) Q5：核酸雜交篩選寡核苷酸探針遵循哪些原則？ A5：（1）長(zhǎng)18-50 nt，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量低；較短探針特異性會(huì)差些。 （2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異核酸雜交。 （3）探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。 （4）避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)），如-CCCCC-。 （5）一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸庫(kù)中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。 Q6：合成的寡核苷酸探針具有哪些優(yōu)點(diǎn)？ A6：（1）由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短，如20 nt的寡核苷酸探針在濃度為100 ng/ml，靶序列為1-100 pg、1 kb片段時(shí)，達(dá)到最大程度的核酸分子雜交只需10 min，而用2 kb的克隆探針在同樣條件下達(dá)到完全核酸分子雜交則需16 h。 （2）寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基的錯(cuò)配能大幅度地降低雜交體的Tm值。 （3）一次可大量合成寡核苷酸探針（1-10 mg），使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過(guò)細(xì)心篩選序列或選擇相對(duì)長(zhǎng)的序列（＞30 nt）也可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18-40個(gè)堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。    |
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