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1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MCM4201完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HMCs，置于37℃、飽和濕度5%CO2的孵箱內(nèi)貼壁傳代培養(yǎng)，隔日換液,0.25%胰酶3~4天消化、傳代。取6~9代對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3~5×105個(gè)細(xì)胞接種6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合70%~80%后用無血清Opti-MEM培養(yǎng)基同步化24h，用于RNA轉(zhuǎn)染及不同環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。 2、siRNA合成與轉(zhuǎn)染 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的人SAA全長基因(GenBank Acc. No. NM_001664.2)由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成RNAi的siRNA，SAA-siRNA：5′-GCUCAGACAAAUACUUCCAUGCUCG-3′；HMCs共分7組：（1）正常對照組（NG，含葡萄糖5.5mmol/L）；（2）高糖組（HG，含葡萄糖30mmol/L）；(3)等滲對照組（Man+ NG，含5.5mM葡萄糖及24.5mM的甘露醇）；(4) 波動(dòng)糖組（FG, 含葡萄糖30mmol/L與含葡萄糖5.5mmol/L MCM培養(yǎng)基每4小時(shí)交替培養(yǎng)）；（5）高糖+脂質(zhì)體對照組（HG+Lipo）；（6）高糖+陰性轉(zhuǎn)染對照組（HG+negative-siRNA）；(7) 高糖+SAA-siRNA組（HG+SAA-siRNA）。以綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）標(biāo)記的siRNA做對照，轉(zhuǎn)染48h后在熒光倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照Lipofectamine?2000說明書進(jìn)行。于0h、12h、24h、48h末收集各組細(xì)胞上清。 3 、總RNA提取及cDNA的合成 各組分別作用48h后按5×106～1×107個(gè)細(xì)胞加1ml TRIzol低溫吹打，后續(xù)操作按Trizol說明書進(jìn)行，最后用DEPC處理的超純水溶解RNA，60℃孵育5 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，分光光度計(jì)測定其純度和濃度。cDNA合成的反應(yīng)體系按照試劑盒進(jìn)行：① 5×PrimeScriptTM Buffer（for Real Time） 4 μl; ② PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1μl;③ Oligo dT Primer（50 μM）1μl;④Random 6 mers（100 μM）1μl;⑤ Total RNA 1μg;⑥ 加RNase Free dH2O至20μl反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃，15min；85℃，15s反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 4 、實(shí)時(shí)定量PCR 采用SYBRGreen嵌合熒光進(jìn)行反應(yīng)，按說明書配制25μl的反應(yīng)體系，①SYBR? Premix Ex TaqTM II（2×）12.5 μl；②PCR Forward Primer（10 μM）1μl；③PCR Reverse Primer（10 μM）1μl； ④模板（cDNA溶液）2μl；⑤dH2O 8.5 μl。陰性對照組加入未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板。上下游引物均由大連寶生物工程有限公司（Takara）設(shè)計(jì)合成(表1)，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，58~62℃退火20s，72℃延伸30s同時(shí)獲取熒光，共40個(gè)循環(huán)，后行產(chǎn)物的溶解曲線分析, 得到樣品量的參數(shù)Ct值(循環(huán)閾值)。以2-ΔΔCt 表示基因的相對表達(dá)量，ΔΔCt=[Ct(待測基因)-Ct(GAPDH)]試驗(yàn)組-[Ct(待測基因)-Ct(GAPDH)]對照組。 5 、ELISA法檢測細(xì)胞上清液中FN、SAA、TNF蛋白的含量 取不同處理因素作用0h、12h、24h、48h的細(xì)胞上清液，無菌管收集，6000轉(zhuǎn)，4℃，離心10分鐘，仔細(xì)收集上清，后續(xù)操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀450nm波長處，以空白對照孔調(diào)零，直接測定吸光值，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算成各蛋白的濃度值。 6、 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以 表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD, Dunnett’s T3，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [ Last edited by Mally89 on 2011-4-5 at 15:04 ] |
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 ！已經(jīng)為中文了，故如下：1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MCM4201完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HMCs，置于37℃、飽和濕度5%CO2的孵箱內(nèi)貼壁傳代培養(yǎng)，隔日換液,0.25%胰酶3~4天消化、傳代。取6~9代對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3~5×105個(gè)細(xì)胞接種6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合70%~80%后用無血清Opti-MEM培養(yǎng)基同步化24h，用于RNA轉(zhuǎn)染及不同環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。 2、siRNA合成與轉(zhuǎn)染 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的人SAA全長基因(GenBank Acc. No. NM_001664.2)由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成RNAi的siRNA，SAA-siRNA：5′-GCUCAGACAAAUACUUCCAUGCUCG-3′；HMCs共分7組：（1）正常對照組（NG，含葡萄糖5.5mmol/L）；（2）高糖組（HG，含葡萄糖30mmol/L）；(3)等滲對照組（Man+ NG，含5.5mM葡萄糖及24.5mM的甘露醇）；(4) 波動(dòng)糖組（FG, 含葡萄糖30mmol/L與含葡萄糖5.5mmol/L MCM培養(yǎng)基每4小時(shí)交替培養(yǎng)）；（5）高糖+脂質(zhì)體對照組（HG+Lipo）；（6）高糖+陰性轉(zhuǎn)染對照組（HG+negative-siRNA）；(7) 高糖+SAA-siRNA組（HG+SAA-siRNA）。以綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）標(biāo)記的siRNA做對照，轉(zhuǎn)染48h后在熒光倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照Lipofectamine?2000說明書進(jìn)行。于0h、12h、24h、48h末收集各組細(xì)胞上清。 3 、總RNA提取及cDNA的合成 各組分別作用48h后按5×106～1×107個(gè)細(xì)胞加1ml TRIzol低溫吹打，后續(xù)操作按Trizol說明書進(jìn)行，最后用DEPC處理的超純水溶解RNA，60℃孵育5 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，分光光度計(jì)測定其純度和濃度。cDNA合成的反應(yīng)體系按照試劑盒進(jìn)行：① 5×PrimeScriptTM Buffer（for Real Time） 4 μl; ② PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1μl;③ Oligo dT Primer（50 μM）1μl;④Random 6 mers（100 μM）1μl;⑤ Total RNA 1μg;⑥ 加RNase Free dH2O至20μl反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃，15min；85℃，15s反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 4 、實(shí)時(shí)定量PCR 采用SYBRGreen嵌合熒光進(jìn)行反應(yīng)，按說明書配制25μl的反應(yīng)體系，①SYBR? Premix Ex TaqTM II（2×）12.5 μl；②PCR Forward Primer（10 μM）1μl；③PCR Reverse Primer（10 μM）1μl； ④模板（cDNA溶液）2μl；⑤dH2O 8.5 μl。陰性對照組加入未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板。上下游引物均由大連寶生物工程有限公司（Takara）設(shè)計(jì)合成(表1)，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，58~62℃退火20s，72℃延伸30s同時(shí)獲取熒光，共40個(gè)循環(huán)，后行產(chǎn)物的溶解曲線分析, 得到樣品量的參數(shù)Ct值(循環(huán)閾值)。以2-ΔΔCt 表示基因的相對表達(dá)量，ΔΔCt=[Ct(待測基因)-Ct(GAPDH)]試驗(yàn)組-[Ct(待測基因)-Ct(GAPDH)]對照組。 5 、ELISA法檢測細(xì)胞上清液中FN、SAA、TNF蛋白的含量 取不同處理因素作用0h、12h、24h、48h的細(xì)胞上清液，無菌管收集，6000轉(zhuǎn)，4℃，離心10分鐘，仔細(xì)收集上清，后續(xù)操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀450nm波長處，以空白對照孔調(diào)零，直接測定吸光值，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算成各蛋白的濃度值。 6、 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以 表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD, Dunnett’s T3，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Keywords: 細(xì)胞培養(yǎng) SiRNA PCR |
3樓2011-03-30 10:38:55
seaharrier
鐵桿木蟲 (知名作家)
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