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[交流]
【求助】幾個關(guān)于實時定量PCR的問題
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在PCR條件優(yōu)化時，以什么為模板呢，含目的片段的質(zhì)粒？cDNA？還是基因組？還是都可以呢？ 熔接曲線能區(qū)分引物二聚體和非特異性條帶嗎？ |
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nininini(金幣+1):謝謝參與
nininini(金幣+4): 2011-04-06 19:18:55
nininini(金幣+1):謝謝參與
nininini(金幣+4): 2011-04-06 19:18:55
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質(zhì)粒比cDNA和基因組DNA更容易獲得，所以要優(yōu)化PCR，可以用質(zhì)粒作模板。 融解曲線可以區(qū)分的。融解曲線的峰會告訴你有多少種產(chǎn)物，峰的位置(橫坐標，溫度）指示了這些產(chǎn)物各自的熔解溫度。假如只有一個峰，就是特異產(chǎn)物啦（tm值符合設(shè)計引物時分析的結(jié)果）。引物二聚體因為片段小，tm值也小，峰會比較靠前。非特異條帶則不一定。 因為特異產(chǎn)物得到的良好擴增，所以它的峰是最高的（縱坐標，熒光信號強度）。引物二聚體和非特異條帶的峰一般比較低。 |
cnb19873樓2011-04-06 19:12:08
4樓2011-04-06 19:21:37
★ ★
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-04-06 19:46:07
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-04-06 19:46:07
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差別不大，最關(guān)鍵的是cDNA要做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶很貴啊……所以一般都用質(zhì)粒優(yōu)化。 如果用的是sybr green一類的熒光染料，引物二聚體會影響熒光定量PCR的結(jié)果的。sybr green可以非特異地和雙鏈DNA結(jié)合，不管是目的產(chǎn)物、引物二聚體還是非特異產(chǎn)物，都可以產(chǎn)生熒光信號，而儀器是不能區(qū)分它們的信號的，所以引物二聚體和非特異產(chǎn)物會干擾定量結(jié)果。 可以試著提高退火溫度，看看能不能減少引物二聚體。有沒有二聚體就看融解曲線好了，跑膠的話，看不出是殘余的引物還是引物二聚體。 |
5樓2011-04-06 19:32:57
6樓2011-04-06 20:05:57
簡單回復(fù)
2011-04-06 23:16
回復(fù)
nininini(金幣+1):謝謝參與
xiaogenv11樓
2011-04-09 09:57
回復(fù)
nininini(金幣+1):謝謝參與
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