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利用大腸桿菌的偏愛密碼子，把三個LNK-16串聯(lián)起來，根據(jù)串聯(lián)起來的氨基酸殘基，通過反向翻譯出它的目的基因片段。在目的基因片段兩端加入限制性酶切位點和保護堿基，利用SOEingPCR的方法把目的基因片段分成四段互補的引物。人工這合成這四段引物，通過TD-PCR方法最終擴增出目的基因。把目的基因和質(zhì)粒載體PET30a(+)進行雙酶切后，利用T4DNA連接酶重新構(gòu)建出質(zhì)粒載體PET30a(+)-LNK-16，通過雙酶切和PCR鑒定成功構(gòu)建了載體，經(jīng)測序表明與設(shè)計的目的基因完全相同。 把含有測序完全正確載體的菌體大量表達，經(jīng)ITPG誘導后，在大腸桿菌包涵體中表達出目的蛋白，目的蛋白純化后在三乙醇胺緩沖液中用激肽釋放酶酶切，酶解液對大腸桿菌表現(xiàn)出抗菌活性。從而為抗菌肽不能在原核中表達提供的解決的方法，為解決抗菌肽來源問題的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。 |
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fbook(金幣+150, 翻譯EPI+1): 十分感謝你提的寶貴意見…… 2011-04-09 08:14:25
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We connected three LNK-16 peptides by using codon preference of E.coli, and took a reverse translation of its target gene according to the amino acid residues linked together. By adding restriction enzyme sites and protective bases at both ends of the target gene, we divided the target gene into four complementary primers through the method of SOEingPCR. Then we synthesized these four primers and amplified the target gene by TD-PCR. After double digestion of the target gene and plasmid vector PET30a (+), we re-constructed the plasmid vector PET30a (+)-LNK-16 with T4DNA ligase. With double digestion and PCR identification we successfully constructed the vector, and sequencing showed that it was the same as the target gene we designed. After taking mass expression of vector proved to be completely correct by sequencing and ITPG induction, we expressed the target protein in cytorrhyctes of E.coli. After purification, the protein was digested by kallikrein in triethanolamine buffer, and the enzymolysis liquid showed antibacterial activity to E.coli. Thus, the research provided new method for solving the problem of antimicrobial peptides can not be expressed in prokaryote and laid a foundation for solving the source problem of antibacterial peptides. 備注： 1、原文“把含有測序完全正確載體的菌體大量表達”表達似有錯誤，“表達菌體”描述有邏輯問題； 2、原文“從而為抗菌肽不能在原核中表達提供的解決的方法”似應(yīng)改為“從而為抗菌肽不能在原核中表達提供了解決的方法”。 3、水平有限，僅供參考，謝謝。 |
2樓2011-04-08 16:57:25
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