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chaovt714金蟲 (小有名氣)
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生物實驗小技巧 摘自http://zhangchaozw.blog.163.com/ ... 470201139112341998/ SDS-PAGE 1. SDS-PAGE配制過程中，濃縮膠與分離膠可預(yù)先配好大體積（如100ml）預(yù)制膠，儲存在4度冰箱（注：10% APS，TEMED不加），每次配置時只需吸取所需體積的預(yù)制膠加入相應(yīng)體積APS，TEMED即可，預(yù)制膠可儲存半年以上，能節(jié)省很多時間，更重要的是，可大大減少與丙稀酰胺的接觸，減少中毒。。 2. 配膠過程中，普通的SDS-PAGE中加入約13%的甘油，可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的彌散。改進(jìn)過程只需將配方中的水改成60%的甘油即可。。 3. 膠配好后，若過夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含膠玻璃板從制膠槽取下，注意玻璃板上下兩邊緣會有氣體，所以需要加一點電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā)，用保鮮膜包上，然后放4度過夜，第二天在電泳槽內(nèi)直接拔下梳子即可使用。 4. 分離膠用水壓膠不平時，可以換用乙醇（濃度無要求，干凈即可），效果較好。 5. 配置分離膠時因膠凝時收縮常導(dǎo)致加樣孔變淺，可以將加剩的膠放入4℃以降低凝聚速度，而將凝膠放入37度促聚，并隨時用4℃加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面；另外將膠橫放與水平面成10度角也可以減少收縮的影響。 6. 丙烯酰胺放置時間過長（超過一年），會吸水潮解，導(dǎo)致膠不凝。。 7. 凝膠時溫度高凝膠快，但過高時，會影響交連物的孔徑大小，25℃為宜。 8. 氧氣是膠凝固的終止劑，所以盡量避免膠中氣泡出現(xiàn)。。 9. 大腸表達(dá)檢測時，一般要煮樣，但煮出來時常較稠，用8M尿素重懸細(xì)胞后再煮效果較好。 10. 配好的10×TBE經(jīng)過高壓滅菌后，不會形成沉淀，可以用很長時間，而且跑出的條帶也很漂亮。 11. 上樣時，最后保證上樣量一樣，包括體積，當(dāng)體積不同時，可以加緩沖液補(bǔ)全，這樣跑出的膠較為一致。所有的加樣孔都加樣，可以防止邊緣的樣品拖尾，如樣品不多，其余的孔均用上樣緩沖液加滿，防止影響條帶擴(kuò)散。 12. 跑膠時，因為低電壓跑會避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形，所以低電壓泳道會比高電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。。 13. 跑膠過程中，為節(jié)省時間，可以提高電壓，但得注意散熱，可以冰浴跑膠，將電泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，節(jié)省的時間的同時，效果也較好。。 14. 防止條帶跑歪：分離膠配好后4度過夜；在點樣的時候緊靠于上樣兩邊的點樣孔各上20微上樣緩沖液。 15. 電泳完撬膠時根本不需要用撬膠板，用流水沖玻璃板的縫隙處（也就是凝膠部分），一邊沖一邊輕輕掀起玻板，用水去充滿玻板和膠之間的縫隙，很容易能把玻板掀開。接下來把玻板反過來，讓膠面朝下，使其一端浸入到一個盛著水的大平皿中，輕輕晃動，膠很快就會被水帶到平皿中了，絲毫不會損傷膠。。 16. 染色時，為節(jié)省染色時間，可以先將染色液在微波爐內(nèi)加熱5-10秒，不能太久，避免冰醋酸揮發(fā)，然后在水平搖床上放置半個小時即可染色好。如果是舊染色液，隔十分鐘加熱一次。。 17. 脫色時，可不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐中高火里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次即可。效果可能比正常的脫色稍差一點點，不如那樣清楚，只要電泳時比平時多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。。 18. 用硝酸銀染色，那么顯色時如果遲遲不出現(xiàn)條帶，可以再顯色夜里加一點甲醛。如果染色或顯色沒有做好，染成了海帶膠，我們可以復(fù)染。將膠用一蒸水清洗7.8遍，再重新染色，顯色。 19. 脫色時用0.25M NaCl代替脫色液，效果較好，無毒。。 20. 脫色時，在脫色液中加入婁張捏成條狀的擦鏡紙或是面巾紙，由于染料吸附到紙纖維上，可以加速脫色，待紙著色較深時，更換新紙條，不用換液。。 雙向電泳 1. 向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時，先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄塑料片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。 2. 一向電泳時，鹽離子容易聚在膠槽的兩側(cè)，剪一小段IPG膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了，避免一向電泳不好影響最后實驗結(jié)果。。 3. 在做第一相等電聚焦分離的時候，如果空氣濕度大，除濕很重要（可通過空調(diào)或除濕機(jī)），要不等電聚焦儀起的鍍金電極會因為冷凝在上面的水汽產(chǎn)生電火花而燒壞。。 質(zhì)粒提取 1. 質(zhì)粒提取時，最后一步的酒精揮發(fā)對后續(xù)酶切等至關(guān)重要，盡量延長揮發(fā)時間，最好是在空調(diào)的熱風(fēng)中揮發(fā)。 2. 加速燥的方法，70%乙醇清洗過后，再加無水乙醇清洗再倒掉無水乙醇，加速揮發(fā)。。 3. 利用試劑盒中硅膠柱手提質(zhì)粒，手提質(zhì)粒時，配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替試劑盒的solution1、2、3），然后一比一的與飽和碘化鉀或碘化鈉（代替結(jié)合緩沖液）混合，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合，而只要是一樣的質(zhì)粒，試劑盒的硅膠柱可以重復(fù)使用，沒有試劑盒溶液量的限制。。 4. 質(zhì)粒提取的最后一步用TE（水）洗硅膠時，一般是加水后放置一分鐘，再離心收集DNA�？梢约铀螽�(dāng)即離心，再次把離心收集的液體重新加到硅膠柱上，放置一分鐘，離心，這樣得到的質(zhì)粒的回收率要高出10~30%，另外，同一種質(zhì)粒，用過的柱子可以反復(fù)使用（5次）。 。 Western Blot 1. Western Blot在摸索一抗、二抗?jié)舛龋忾]時間，曝光時間等條件時，可以一次轉(zhuǎn)膜后，將膜晾干，裁減成小塊保存，每次取一小塊進(jìn)行條件摸索，可以避免每次都重新跑膠、轉(zhuǎn)膜甚至是重新提取蛋白，可以節(jié)省大量時間。 2. Western Blot時，轉(zhuǎn)膜后暫存晾干的膜于4℃條件下比將蛋白保存在Buffer中更可靠。。 溶液配制 1. 培養(yǎng)基試劑等配制過程中可先將各成分配成母液，并在常用試劑瓶上寫上該試劑配方，方便配制。 2. 劇毒物質(zhì)配制過程中，以往是先根據(jù)要配的濃度與所需體積算好待稱物質(zhì)的量，其實可以先稱好有毒物質(zhì)，再去調(diào)整溶劑的體積，以避免長時間與有毒物質(zhì)接觸。。 PCR、酶切、連接并進(jìn)行凝膠檢測。 1. PCR，酶切時，可以將反應(yīng)液除模板，引物，酶的其他成分配預(yù)混合制成Mix形式，儲貯在-20℃冰箱中，用時取出分裝，可以避免每次條件不均。。 2. 菌落或菌液直接PCR時，預(yù)變性的時間延長至5min，效果較好。 3. PCR的循環(huán)參數(shù)的第一步都是94或95度預(yù)熱3~5分鐘，延伸一般都是72℃，按照這些參數(shù)做PCR一般都可以做出來，但在長片段PCR(>2kb)中，由于DNA模板在94℃高溫20秒以上就會發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)，當(dāng)taq酶遇到模板上的這些錯誤時就會停下來從而使反應(yīng)不能繼續(xù)進(jìn)行，時間越長，模板損壞也越嚴(yán)重，得不到產(chǎn)物的可能性也越大，另外，對于我們實驗中用到的許多taq酶來說，72℃并不是其最佳的反應(yīng)溫度。如Takara LA酶的最適反應(yīng)溫度是68℃，采用92℃預(yù)熱3分鐘，95℃變性15-20秒，退火后于68℃延伸取得很好的效果，擴(kuò)過最長的片段為10kb。。 4. 雙酶切時，兩個酶單獨酶切效果要好很多。在第一個酶切完成后，將體系熱失活（根據(jù)說明書，一般65℃，20min），再進(jìn)行第二個酶切。。 5. 提高酶切效率的方法，將要進(jìn)行酶切的質(zhì)粒DNA直接放于95℃的水浴鍋中10 s，取出自然放冷，再加樣進(jìn)行酶切。 6. 高GC含量的酶切位點如NotI，應(yīng)該用甲基化缺陷的宿主菌如E.coli Top10等。 7. 用酶切作檢測時，在微波爐里面加熱1min即可跑膠檢測，雙酶切可以考慮2min，但酶切不夠充分，回收量可能不夠。 8. 瓊脂糖凝膠跑完后可以二次點樣。。 9. 跑膠過程中，先100V電壓跑約15min，再將電壓調(diào)大至120-130V，進(jìn)行較小差異電泳，可以避免大片段殘存在膠孔不動的情況，跑出來的帶較為漂亮且省時。。 10. 做連接時，連接buffer一定要避免反復(fù)凍融，可在第一次用時就分裝成小份，三次以上凍融會大大降低連接效率。 RNA提取與檢測 1. RNA電泳過程中，預(yù)電泳5-10min 減少了非特異RNA條帶的出現(xiàn)，有利于分離和純化，同時可根據(jù)電泳儀是否冒泡判斷電泳儀裝置是否有誤。。 2. RNA點樣過程中，樣品是在電泳緩沖液液略低于膠表面而不是在高過膠面時加進(jìn)齒槽，避免了加樣時RNA 的擴(kuò)散、加樣后RNA 從齒槽逸出造成RNA的彌散及定位不良等現(xiàn)象。電3-5min 讓RNA進(jìn)入凝膠后再加電泳緩沖液液高過表面，確保了加到每個槽中的RNA量及定位的準(zhǔn)確性，從而有利于RNA的鑒定和純化。(亦適合于DNA)。 其他 1. 超濾對于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，但很適合用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽。 2. 蛋白質(zhì)純化時，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加PMSF（劇毒，蛋白降解抑制劑），建議在上柱子洗脫的時候也加PMSF，一定要用之前再加。。 3. 垂直電泳時，可在電泳糟中放入青霉素小瓶等，可使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。 4. 柱層析時，如果樣品較多，可以將樣放在三角瓶中，用一個輸液管與柱上端連通，并持平，用槍頭引導(dǎo)液體流出，調(diào)好流速。。 5. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，傳代時，不用吹打或刮落，先將上清吸出，適當(dāng)拍打培養(yǎng)瓶，即可見貼壁細(xì)胞脫落，加培養(yǎng)基混懸即可。 6. 96孔板上氣泡的去除方便快捷的方法，用吹風(fēng)機(jī)直接對著板用熱風(fēng)吹，1~2s見效。 7. 倒制平板時，避免皿蓋上的水汽的方法，在倒制培養(yǎng)基平板時，將倒制的平板迅速的摞在一起；如果條件允許，可以在最上面放置一個倒有半培養(yǎng)皿熱水的培養(yǎng)皿，靜置至平板培養(yǎng)基凝固完全。。 [ Last edited by chaovt714 on 2011-4-11 at 16:41 ] |
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