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pumpkin236鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助】基因沉默 已有2人參與
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最近打算做細(xì)胞的基因敲除實(shí)驗(yàn)，昨天做了下預(yù)實(shí)驗(yàn)，心都涼了半截兒了 所以只有來求助強(qiáng)大的小木蟲了 實(shí)驗(yàn)步驟如下： ① 以合適的密度接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板，在轉(zhuǎn)染的前一天換用含10％新生小牛血清而無雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到40％融合時(shí)，換用無血清無雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)并進(jìn)行轉(zhuǎn)染； ② 對(duì)于需要轉(zhuǎn)染的每孔細(xì)胞，用250μl的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基來稀釋5μl的Lipofectamine2000，并在室溫下孵育5min； ③ 用250μl的DMEM無血清培養(yǎng)基來稀釋5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量為100pmol ，siRNA在培養(yǎng)基中最終濃度為50nM）； ④ 將稀釋了的lipofectamine2000（步驟2）和稀釋了的siRNA引物（步驟3）混合均勻，在在室溫下孵育20min促使siRNA引物/lipofectamine2000混合物的形成； ⑤ 直接往每孔中加入siRNA引物/lipofectamine2000混合物500μl，補(bǔ)足無血清培無雙抗培養(yǎng)基至2mL，并輕輕搖晃培養(yǎng)板使其混勻； 但6h以后我去觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全死了。我怕無血清對(duì)細(xì)胞影響大，我還專門用2%血清無雙抗的培養(yǎng)基來稀釋SIRNA和lipofectamine2000。但是6h后細(xì)胞還是死了不少。。。。 求教大家，這是為什么。。我們實(shí)驗(yàn)室?guī)熜值难劬ι掀ぜ?xì)胞如上處理都不會(huì)出現(xiàn)死亡。。。。 大家遇到過如上問題木有？？？ |
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mamadexiao
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 3
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2011-04-16 18:25:34
2樓2011-04-15 10:25:12
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