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WB實驗疑問
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| 做WB時用的上樣緩沖液里面的β-巰基乙醇可以用什么替代？ |
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2樓2011-04-21 23:19:26
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
hongxing616(金幣+3): 十分感謝！！ 2011-04-22 08:30:18
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
hongxing616(金幣+3): 十分感謝！！ 2011-04-22 08:30:18
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可以用二硫蘇糖醇（DTT)、TCEP等代替β-巰基乙醇。 下面是google來的： 1. http://www.biodee.net/Article.aspx?id=194 DTT和巰基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近。但DTT價格略高一些。 2.http://xiaowangzi1546.blog.163.c ... 025201072222510612/ 還原劑是一類能使其他物質被還原或獲得電子的物質。在使其他物質被還原（獲得電子）的過程中，還原劑本身被氧化了，也就是說還原劑通過自身被氧化（失去電子）而使其他物質被還原。 二硫蘇糖醇DTT，beta-巰基乙醇，TCEP等是巰基類還原劑。還原劑可以保護蛋白質上自由的巰基不被氧化，從而避免蛋白質的聚集或變性。在結晶實驗中，一般使用的還原劑工作濃度是1 － 10 mM 。 beta-巰基乙醇是上述三種還原劑中還原能力最差的一個，因為它本身只有一個巰基。它的效果一般只能維持2－3天。因此，在實驗中要每隔2－3天補加一次beta-巰基乙醇來維持它的作用。由于beta-巰基乙醇是揮發(fā)性的，因此，可以在池液中加入beta-巰基乙醇，利用它的揮發(fā)擴散到液滴中去。 二硫蘇糖醇DTT有兩個巰基基團，其作用能維持3－7天。DTT的揮發(fā)性不像beta-巰基乙醇那么強，所以使用時應該直接加入到懸滴中去。DTT還可以通過微透析的方法加入。 TCEP的還原能力比beta-巰基乙醇和DTT都強，它的作用可以維持2－3周。TCEP能使結晶用的緩沖液酸化。與DTT類似，TCEP需要直接加入到懸滴中，因此可以考慮微透析法。 beta-巰基乙醇，DTT，和TECP的作用機制可能不同。像其他添加劑一樣，如果你發(fā)現(xiàn)一類物質對樣品的穩(wěn)定性和結晶有利，則可以去篩選這一類物質中最適合你的樣品的一種。我們建議是，最好這三種還原劑都嘗試一下，去發(fā)現(xiàn)最適合的。 有報道指出還原劑作為沒有自由巰基的蛋白的添加劑的情況下長出了晶體的成功案例。 還原劑可以與金屬離子結合，金屬離子其被還原，而還原劑的作用被抑制。這就使得用重金屬原子作同晶置換法遇到了麻煩。可以使用EDTA來避免還原劑被金屬離子抑制。但是，如果金屬離子是你的樣品蛋白維持活性所必須的，就要小心使用EDTA了。 堿性條件下，beta-巰基乙醇和TECP更穩(wěn)定，效果要好于DTT。酸性條件下，TCEP的穩(wěn)定性也要好過DTT。 DTT可以使Ni被還原，因此在用Ni柱純化His標簽的蛋白時要避免使用DTT，而應該考慮beta-巰基乙醇和TECP。 半胱氨酸也是一種還原劑。在結晶實驗中，半胱氨酸局限性很明顯，那是由于它容易形成六角形的晶體。但是，半胱氨酸是一種有效的添加劑，能帶來明顯的效果，不過需要銘記它的局限性。 如果預期到蛋白會被氧化，從制備樣品開始就要加入還原劑，并且在整個流程中要不斷補加保證其效果。在懸滴法中，可以在池液里加入還原劑，利用還原劑的揮發(fā)擴散，保證懸滴中還原性的環(huán)境。 在確定還原劑和樣品比例時，需要考慮樣品上自由巰基的數(shù)目和樣品濃度。自由巰基數(shù)目越多，樣品濃度越高，還原劑的用量就越大。 含砷化合物與還原劑不能共用。 二甲胂和 二甲胂酸鈉是結晶中常使用的含砷化合物，它們不能與還原劑共同使用。其他不能與還原劑一起使用的物質還包括：硝酸銨，過氧化氫，高氯酸鉀，硝酸鈉。在使用某種物質之前，應該先查閱Material Safety Data Sheet (MSDS) 。 [ Last edited by 西瓜 on 2011-4-22 at 08:31 ] |
3樓2011-04-21 23:56:33
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