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yoyoh0032木蟲 (著名寫手)
掃盲村村長
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mRNA提取、分離純化
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從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉(zhuǎn)化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構(gòu)建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達和調(diào)控的分析;比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題�？傊甤DNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發(fā)展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進了載體系統(tǒng)，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當載體(噬菌體或質(zhì)粒)�！ ∫�、RNA制備 模板mRNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點,容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實驗成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。 細胞內(nèi)總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA流經(jīng)oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 二、cDNA第一鏈的合成 所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽亞基,兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNA NA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。 AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長的oligo(dT)�！ ∪�、cDNA第二鏈的合成 cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: (1) 自身引導法 合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu),這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物,當?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán),即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將導致對應(yīng)于mRNA 5'端序列出現(xiàn)缺失和重排,因而該方法目前很少使用。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個主要優(yōu)點: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物,無須進一步處理和純化; (3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。 四、cDNA的分子克隆 已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質(zhì)�；蚴删w中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內(nèi)切酶識別位點片段,也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴增后再克隆入適當載體。 第二節(jié) 動植物組織mRNA提取 一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。 二、設(shè)備 研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽�！ ∪�、試劑 1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。 2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS�！ �4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS�！ ∷�、操作步驟 �。ㄒ唬﹦又参锟俁NA提取-Trizol法 Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆�！ �1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。 5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃�！ 注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。 2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 �。ǘ﹎RNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。 1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。 4、將（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液�！ �5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。 7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20℃30分鐘。 8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘�！ �9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。 [注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。 第三節(jié) 植物病毒RNA提取 大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。 一、材料 提純TMV病毒液（10mg/ml）。 二、設(shè)備 冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。 四、操作步驟 1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘�！ �2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。 3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4℃下12000g離心10分鐘�！ �4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。 5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘�！ �6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中�！ �7、取10ml進行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。 [注意] 1、整個操作應(yīng)盡可能在低溫下進行。 2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍祝话阈枰啻芜M行酚/氯仿的抽提。mRNA的分離與純化 真核細胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。 mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。 寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA 一、試劑準備 1．3M醋酸鈉（pH 5.2） 2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。 4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC 二、操作步驟 1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。 2．用DEPC處理的1ml注射器或適當?shù)奈�，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。 3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。 5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。 6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。 7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。 8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。 9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。 10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。 三、注意事項 1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。 2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。 3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。 4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。 5．一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2% |
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