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我剛開(kāi)始學(xué)習(xí)做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，好多方面還不很懂，這張圖是我做的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物拍的照，我基本上都是按照操作步驟做下來(lái)的，結(jié)果就只有兩個(gè)孔能看到點(diǎn)東西，而且還不清晰，另外我發(fā)現(xiàn)自己做的膠沒(méi)別人做的好看，白的白，黑的黑，還有臟東西，我之前已經(jīng)把錐形瓶什么的都洗干凈了，可還是這樣，為什么呢 高手能不能給我點(diǎn)建議，謝謝啦 |
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2樓2011-05-12 15:44:59
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西瓜(金幣+2, EPI+1): Ok~ 2011-05-12 16:04:30
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西瓜(金幣+2, EPI+1): Ok~ 2011-05-12 16:04:30
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1: PCR這個(gè)東西其實(shí)說(shuō)實(shí)話，做得多了也就很隨意了，但是對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)還是要注意各個(gè)操作細(xì)節(jié)，沒(méi)有做出來(lái)沒(méi)關(guān)系，可以改變體系，改變溫度，延伸時(shí)間繼續(xù)做。 2：你的膠確實(shí)配的不太好，有可能是瓊脂糖溶解的不徹底，核算染料沒(méi)有完全混合到緩沖液中，還有緩沖液是不是新配置的呢？ 出現(xiàn)問(wèn)題了，就要考慮到各個(gè)環(huán)節(jié)是不是出現(xiàn)了什么問(wèn)題，然后找到問(wèn)題，一一解決，那么最終一張完美的PCR圖就會(huì)呈現(xiàn)到你的面前！ 加油！ |
3樓2011-05-12 15:48:54
4樓2011-05-12 16:11:47
5樓2011-05-12 16:13:10
6樓2011-05-12 16:14:06
西瓜
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dhd997(金幣+5, EPI+1): 辛苦，一并獎(jiǎng)勵(lì) 2011-05-13 09:13:27
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
dhd997(金幣+5, EPI+1): 辛苦，一并獎(jiǎng)勵(lì) 2011-05-13 09:13:27
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1.在我看來(lái)，你這個(gè)是PCR沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物。你標(biāo)出來(lái)的兩條帶很小且模糊，很可能是引物二聚體。PCR擴(kuò)增不出來(lái)的原因?qū)嵲谔嗔�，不好說(shuō)。 2.Maker跑得很好，條帶亮，沒(méi)有拖尾（沒(méi)有降解，電泳中沒(méi)有污染DNA酶），泳道也端端正正，說(shuō)明做膠（瓊脂糖、EB、緩沖液等等）、上樣操作、電泳、拍照都沒(méi)有大問(wèn)題。當(dāng)然如果偏巧就是PCR產(chǎn)物那幾個(gè)孔破了或者沒(méi)上到樣品，或者PCR產(chǎn)物降解什么的，我就沒(méi)話說(shuō)了…… 3.你說(shuō)膠不好，我不認(rèn)為，我覺(jué)得挺好的： （1）“白的白，黑的黑”：【1】你這個(gè)膠應(yīng)該是配膠時(shí)就加了EB吧。電泳的時(shí)候，EB會(huì)從正極向負(fù)極移動(dòng)（與DNA反向）。你看你的膠，下半部是黑的，上半部是白的，那是因?yàn)镋B都移到上面去了，所以上半部背景會(huì)更亮�！�2】你標(biāo)出來(lái)的那兩條帶上面，有一條黑帶，應(yīng)該是溴酚藍(lán)（電泳時(shí)看到的那條藍(lán)色的線）。【3】maker最上那條帶的位置，有一道黑線，這個(gè)我就不懂了。可能也是上樣緩沖液的指示劑（類似溴酚藍(lán)）。你跑電泳時(shí)看到這個(gè)位置有顏色嗎？ （2）“臟東西”：【1】可能是加EB加晚了，此時(shí)瓊脂糖快凝固了，EB分散不開(kāi)。加EB后記得搖勻。【2】我更傾向這個(gè)原因：機(jī)器不干凈。就是說(shuō)你拍照的儀器，放膠的那個(gè)地方可能臟了。這個(gè)很常見(jiàn)的。我們一般是鋪層保鮮膜，再把膠放上去拍照，覺(jué)得臟了就換一張保鮮膜。 （3）“錐形瓶洗干凈”：我們跑膠，錐形瓶、梳子、模具這些幾乎不洗的，沒(méi)問(wèn)題滴！ 你說(shuō)同學(xué)的好，不如也貼上來(lái)比較比較吧。 啰嗦了一堆，觀點(diǎn)就一個(gè)：電泳很好，PCR可能有問(wèn)題。 |
7樓2011-05-12 16:28:58
西瓜
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8樓2011-05-12 16:35:49
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9樓2011-05-12 16:59:48
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西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-05-12 21:28:38
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-05-12 21:28:38
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前面如果步驟都做得沒(méi)錯(cuò)的話，有可能向樓上說(shuō)的，做的膠不干凈，也有可能跟最后的拍相技術(shù)有關(guān)。我剛開(kāi)始學(xué)這東西時(shí)，也總是感覺(jué)相片出來(lái)不如別人做的好看，你試著調(diào)調(diào)機(jī)器的對(duì)比度、亮度什么的。再一個(gè)就是，自己的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，雖說(shuō)都是和別人一樣，一步步做下來(lái)的，但最后結(jié)果就是和別人不一樣，這還是說(shuō)明自己的技術(shù)不過(guò)關(guān)，沒(méi)事，多練練就好，我剛開(kāi)始時(shí)也和你現(xiàn)在一樣，連跑個(gè)膠都跑不出圖像來(lái)，后來(lái)慢慢練練就好了。實(shí)驗(yàn)這個(gè)東西就是這樣，又是錯(cuò)都不知道自己錯(cuò)在哪，對(duì)也不知道自己對(duì)在哪，操作熟練了就好了。 |
10樓2011-05-12 18:37:57
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