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happy-j

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Originally posted by 314300420 at 2011-05-21 09:14:42:
1. 調(diào)整蛋白濃度的時(shí)候一般選擇所用的裂解液來(lái)調(diào)整，一來(lái)可以保證體系里面的離子強(qiáng)度保持不變，二來(lái)因?yàn)榱呀庖豪锩婧兄T如EDTA等可以抑制蛋白酶活性，可以盡量避免蛋白被降解，如果沒(méi)有裂解液也可以用PBS稀釋，至 ...

不好意思，想再問(wèn)你個(gè)問(wèn)題。

請(qǐng)問(wèn)，用BSA跟用脫脂牛奶封閉有很大的差別嘛？我做了個(gè)對(duì)比，但是不知道是我實(shí)驗(yàn)中其他環(huán)節(jié)出差別了呢還是確實(shí)是兩個(gè)封閉液的差別，結(jié)果一個(gè)化學(xué)發(fā)光后效果很好，而另一個(gè)卻沒(méi)有任何條帶，但是麗春紅染色的時(shí)候兩張膜上都有蛋白。求取經(jīng)驗(yàn)值O(∩_∩)O~

您的分離膠以及濃縮膠的是提前一天配制還是當(dāng)天配制當(dāng)天跑膠？提前一天配膠跟當(dāng)天配膠當(dāng)天跑膠會(huì)有很大影響嗎？如果提前一天制膠那如何保存？

另外，你能幫我看一下二抗點(diǎn)膜測(cè)試結(jié)果嘛，選擇哪個(gè)點(diǎn)比較合適呢？

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11樓2011-05-23 14:49:30

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314300420

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引用回帖:

Originally posted by happy-j at 2011-05-23 14:49:30:
不好意思，想再問(wèn)你個(gè)問(wèn)題。

請(qǐng)問(wèn)，用BSA跟用脫脂牛奶封閉有很大的差別嘛？我做了個(gè)對(duì)比，但是不知道是我實(shí)驗(yàn)中其他環(huán)節(jié)出差別了呢還是確實(shí)是兩個(gè)封閉液的差別，結(jié)果一個(gè)化學(xué)發(fā)光后效果很好，而另一個(gè)卻沒(méi)有 ...

封閉效果絕大多數(shù)情況下BSA會(huì)好些，封閉充分，背景相對(duì)干凈，相對(duì)來(lái)說(shuō)還可以起到提高檢測(cè)敏靈敏度的效果。對(duì)于檢測(cè)一些磷酸化和糖基化蛋白時(shí)則通常只選擇BSA而不選擇奶粉，否則會(huì)產(chǎn)生高背景。
你的是奶粉封閉結(jié)果沒(méi)有條帶？可能奶粉本身質(zhì)量不行，或者奶粉溶入TBST后PH值降低太多，導(dǎo)致抗體失活了。一般情況不會(huì)出現(xiàn)一個(gè)有一個(gè)沒(méi)有的情況，但不排除特例，我用過(guò)Bioworld公司的E-Cadherin抗體，使用奶粉檢測(cè)背景高，分子量位置不對(duì)，投訴反饋后他們建議使用BSA封閉，果然效果很好，條帶特異，分子量正確，沒(méi)有背景，當(dāng)時(shí)感覺(jué)很神奇....
膠可以提前配，放在自封袋中，加點(diǎn)去離子水保濕，4℃放置一周使用沒(méi)有問(wèn)題
二抗使用第三個(gè)梯度就可以

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12樓2011-05-23 16:18:04

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引用回帖:

Originally posted by 314300420 at 2011-05-23 16:18:04:
封閉效果絕大多數(shù)情況下BSA會(huì)好些，封閉充分，背景相對(duì)干凈，相對(duì)來(lái)說(shuō)還可以起到提高檢測(cè)敏靈敏度的效果。對(duì)于檢測(cè)一些磷酸化和糖基化蛋白時(shí)則通常只選擇BSA而不選擇奶粉，否則會(huì)產(chǎn)生高背景。
你的是奶粉封閉 ...

嗯，3Q~

好幸運(yùn)，碰上了大俠O(∩_∩)O~

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13樓2011-05-23 16:38:23

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幫不上

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14樓2011-05-25 13:04:07

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學(xué)習(xí)了，感謝

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15樓2011-06-03 21:11:57

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1樓: Originally posted by happy-j at 2011-05-17 23:58:07:
WESTERN BLOT新手，重復(fù)了好幾次都快郁悶了。。。
第一張圖是β-actin的結(jié)果，第一次的時(shí)候結(jié)果挺好的，可是不知道為什么最近幾次都是這樣，出來(lái)的條帶不清楚而且很細(xì)。。。而且還有說(shuō)不清的雜點(diǎn)，呼喚高手指點(diǎn)~ ...

樓主的WB結(jié)果做好了嗎？我做蛋白磷酸化的探測(cè)，怎么也探測(cè)不到啊。

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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~

16樓2011-12-12 20:21:21

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1336082樓: Originally posted by 314300420 at 2011-05-19 21:47:44
先將SDS-PAGE跑的好看點(diǎn)(考馬斯亮藍(lán)染色)，轉(zhuǎn)膜后用立春紅染色(可以將結(jié)果掃描存著)，觀察和考染的效果是否相當(dāng)，最好把圖貼上來(lái)會(huì)更直觀些。
另外聽(tīng)樓主的意思，是沒(méi)有做過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)吧？抗體說(shuō)明書(shū)給的建議稀釋度都 ...

你好！看了你的WB的實(shí)驗(yàn)，做得好漂亮哦。我想問(wèn)問(wèn)你哦，我最近做85KD的，買的是單抗CST的，結(jié)果做出來(lái)出現(xiàn)很多雜帶，而且目標(biāo)帶與上下的雜帶還會(huì)連在一起？做了幾次每次都有雜帶，估計(jì)是雜帶避免不了，有什么辦法使目標(biāo)帶與上下雜帶不連起來(lái)嗎？

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17樓2013-02-21 20:58:23

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1599143樓: Originally posted by 乖乖寶貝 at 2013-02-21 20:58:23
你好！看了你的WB的實(shí)驗(yàn)，做得好漂亮哦。我想問(wèn)問(wèn)你哦，我最近做85KD的，買的是單抗CST的，結(jié)果做出來(lái)出現(xiàn)很多雜帶，而且目標(biāo)帶與上下的雜帶還會(huì)連在一起？做了幾次每次都有雜帶，估計(jì)是雜帶避免不了，有什么辦法使 ...

85KD的蛋白，膠濃度選擇需要相對(duì)低些才能起到比較好的分離效果，建議分離膠濃度使用8%，如果原來(lái)用的就是8%，只能通過(guò)延長(zhǎng)電泳時(shí)間提高分離效果了，另外可以調(diào)整抗體稀釋度，把雜帶消除是上策

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乖乖寶貝

18樓2013-02-22 09:24:29

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1599171樓: Originally posted by 314300420 at 2013-02-22 09:24:29
85KD的蛋白，膠濃度選擇需要相對(duì)低些才能起到比較好的分離效果，建議分離膠濃度使用8%，如果原來(lái)用的就是8%，只能通過(guò)延長(zhǎng)電泳時(shí)間提高分離效果了，另外可以調(diào)整抗體稀釋度，把雜帶消除是上策...

一張是轉(zhuǎn)膜后麗春紅染膜，85KD的轉(zhuǎn)膜應(yīng)該可以了，但是封閉，抗體孵育曝光，很多雜帶，表達(dá)也很高，最重要是目標(biāo)條帶和上下雜帶連在一起了。一抗?jié)舛认♂尯螅s帶仍然沒(méi)有消失，現(xiàn)在就想辦法把目標(biāo)和雜帶盡量分開(kāi)些……我用的是10%的膠，明天用8%的試試看

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未命名.JPG

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19樓2013-02-22 12:22:12

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1599205樓: Originally posted by 乖乖寶貝 at 2013-02-22 12:22:12
一張是轉(zhuǎn)膜后麗春紅染膜，85KD的轉(zhuǎn)膜應(yīng)該可以了，但是封閉，抗體孵育曝光，很多雜帶，表達(dá)也很高，最重要是目標(biāo)條帶和上下雜帶連在一起了。一抗?jié)舛认♂尯�，雜帶仍然沒(méi)有消失，現(xiàn)在就想辦法把目標(biāo)和雜帶盡量分開(kāi)些 ...

可以繼續(xù)稀釋抗體，不知道你的蛋白樣品是什么，如果是純蛋白還可以降低上樣量，相信可以調(diào)整出單條帶的結(jié)果

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20樓2013-02-22 20:55:30

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