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happy-j銀蟲 (小有名氣)
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WB結(jié)果不理想，呼喚幫助
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WESTERN BLOT新手，重復(fù)了好幾次都快郁悶了。。。 第一張圖是β-actin的結(jié)果，第一次的時候結(jié)果挺好的，可是不知道為什么最近幾次都是這樣，出來的條帶不清楚而且很細。。。而且還有說不清的雜點，呼喚高手指點~~~ 具體實驗操作： 從Hep G2細胞中用碧云天的中性裂解液提的蛋白，用的abmart的一抗，稀釋比例1:4000（試用裝，說明書中說可用1:5000做），二抗稀釋比例1:4000。 上樣蛋白100ug/20ul 分離膠濃度12%，電泳條件：100V，150min; 轉(zhuǎn)膜條件：250mA, 70min; 5%脫脂奶粉封閉1h, 一抗4度孵育過夜 第二張圖是硫酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的結(jié)果，蛋白源及提取方法、電泳、轉(zhuǎn)膜條件如上�？贵w應(yīng)該沒有問題，稀釋比例按照說明進行。這個為什么條帶之間界限不清楚，而且為什么在條帶交際處顯色較深？ [ Last edited by happy-j on 2011-5-17 at 23:59 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
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lstt09nk(金幣+6): 感謝參與，歡迎常來 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金幣+1): 第一次發(fā)帖求助，非常感謝提供解決意見。 2011-05-19 20:29:08
lstt09nk(金幣+6): 感謝參與，歡迎常來 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金幣+1): 第一次發(fā)帖求助，非常感謝提供解決意見。 2011-05-19 20:29:08
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內(nèi)參的抗體是不是回收使用了？現(xiàn)在天氣比較熱，抗體容易失活效價變低，而且會產(chǎn)生雜點和高背景，建議不要回收。根據(jù)你內(nèi)參的結(jié)果分析，主要原因就是熒光強度低，可提高抗體濃度，另外使用的發(fā)光液的敏感性很重要，好的ECL發(fā)光液可以節(jié)省抗體，降低背景值，Millipore的效果很不錯（貨號WBKLS0500）。 第二張圖的結(jié)果，分析認為是上樣量過大，100ug/泳道，已經(jīng)過載，超過了凝膠的分辨率，相鄰孔的蛋白已經(jīng)連在一起了，效果和沒有梳子是一樣的。你可以看看100ug的上樣量，考馬斯亮藍染色的結(jié)果是什么樣的，再對比下20ug的上樣量是什么效果。 |
3樓2011-05-19 09:41:41
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare(金幣+3, EPI+1): 2011-05-20 17:03:51
silicare(金幣+3, EPI+1): 2011-05-20 17:03:51
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先將SDS-PAGE跑的好看點(考馬斯亮藍染色)，轉(zhuǎn)膜后用立春紅染色(可以將結(jié)果掃描存著)，觀察和考染的效果是否相當(dāng)，最好把圖貼上來會更直觀些。 另外聽樓主的意思，是沒有做過預(yù)實驗吧？抗體說明書給的建議稀釋度都是一個范圍，沒有什么通用的稀釋度的，不同的細胞(組織)相同蛋白的表達量也是不一樣的，最好先做預(yù)實驗，摸好合適的抗體濃度再做整張膜的正式實驗。 附件里面有我做過實驗的圖片，可做為質(zhì)控參考，  |
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乖乖寶貝7樓2011-05-19 21:47:44
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4樓2011-05-19 11:33:40
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~~~~ 5樓2011-05-19 20:39:40
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6樓2011-05-19 20:40:45
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非常感謝您提供的實例參照，偶像~~ 還有幾個問題想問一下： 1、制備蛋白樣品的時候，為什么要用RIPA來稀釋呢？這個如果用ddH2Ol來調(diào)節(jié)蛋白濃度會有多大影響？ 2、你用于蛋白抽提的RIPA是哪個公司的？配方是什么樣的呢？我一直懷疑我的蛋白有問題，但是同實驗的人用同樣的RIPA做出來的結(jié)果比我的結(jié)果要好，所以不敢貿(mào)然更換RIPA，我用的是碧云天的 3、摸索一抗稀釋倍數(shù)的時候一般如何設(shè)定？我之前有做過預(yù)實驗，分別將稀釋倍數(shù)設(shè)定為1:1000和1:1500，結(jié)果沒有太大差別。說明書上給的建議是1:1000-1:2000. 另外，二抗的稀釋倍數(shù)也需要摸索嘛？ 再次感謝~~~ 期待回復(fù)~~^_^ |
8樓2011-05-20 23:36:44
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1. 調(diào)整蛋白濃度的時候一般選擇所用的裂解液來調(diào)整，一來可以保證體系里面的離子強度保持不變，二來因為裂解液里面含有諸如EDTA等可以抑制蛋白酶活性，可以盡量避免蛋白被降解，如果沒有裂解液也可以用PBS稀釋，至于用水稀釋的影響，自己沒有做過對比，所以也不清楚 2. 裂解液大概成分就是：50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.02% NaN3, 1 mmol/L PMSF, and 10 µmol/L leupeptin ，個人認為裂解液問題幾率比較小，你也說了其他人用著比你做的好 3. 預(yù)實驗一抗?jié)舛仍O(shè)定：一般建議1:1000~1:2000我就做一個最高值，一個最低值。范圍要是廣，像Epitomics的抗體很多都是1:1000~1:10000，就會做3個，1:1000, 1:2000, 1:5000，另外需要強調(diào)的是我使用的曝光系統(tǒng)是X膠片感光，你的應(yīng)該是機器曝光的吧？感覺機器曝光靈敏度會差很多，所以你的抗體濃度可能會比建議的濃度要高些才行(自己驗證了才知道)，梯度一般倍比，梯度差小了基本不會有變化的。 4.二抗第一次使用可以做個點膜的檢測，按照倍比稀釋后(TBST或PBST稀釋)，取1ul，點到NC膜上，干燥后直接加ECL曝光，選擇一個濃度(熒光不能弱，也不要太強，判斷得有一定經(jīng)驗)，如圖曝光30S，我會選擇第3或者第4個濃度做為二抗使用濃度，以后不必摸索，直接使用。 |
9樓2011-05-21 09:14:42
happy-j
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10樓2011-05-21 10:05:50
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