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happy-j銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
WB結(jié)果不理想，呼喚幫助
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WESTERN BLOT新手，重復(fù)了好幾次都快郁悶了。。。 第一張圖是β-actin的結(jié)果，第一次的時(shí)候結(jié)果挺好的，可是不知道為什么最近幾次都是這樣，出來的條帶不清楚而且很細(xì)。。。而且還有說不清的雜點(diǎn)，呼喚高手指點(diǎn)~~~ 具體實(shí)驗(yàn)操作： 從Hep G2細(xì)胞中用碧云天的中性裂解液提的蛋白，用的abmart的一抗，稀釋比例1:4000（試用裝，說明書中說可用1:5000做），二抗稀釋比例1:4000。 上樣蛋白100ug/20ul 分離膠濃度12%，電泳條件：100V，150min; 轉(zhuǎn)膜條件：250mA, 70min; 5%脫脂奶粉封閉1h, 一抗4度孵育過夜 第二張圖是硫酸轉(zhuǎn)移酶蛋白的結(jié)果，蛋白源及提取方法、電泳、轉(zhuǎn)膜條件如上。抗體應(yīng)該沒有問題，稀釋比例按照說明進(jìn)行。這個(gè)為什么條帶之間界限不清楚，而且為什么在條帶交際處顯色較深？ [ Last edited by happy-j on 2011-5-17 at 23:59 ] |
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happy-j
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非常感謝您提供的實(shí)例參照，偶像~~ 還有幾個(gè)問題想問一下： 1、制備蛋白樣品的時(shí)候，為什么要用RIPA來稀釋呢？這個(gè)如果用ddH2Ol來調(diào)節(jié)蛋白濃度會(huì)有多大影響？ 2、你用于蛋白抽提的RIPA是哪個(gè)公司的？配方是什么樣的呢？我一直懷疑我的蛋白有問題，但是同實(shí)驗(yàn)的人用同樣的RIPA做出來的結(jié)果比我的結(jié)果要好，所以不敢貿(mào)然更換RIPA，我用的是碧云天的 3、摸索一抗稀釋倍數(shù)的時(shí)候一般如何設(shè)定？我之前有做過預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別將稀釋倍數(shù)設(shè)定為1:1000和1:1500，結(jié)果沒有太大差別。說明書上給的建議是1:1000-1:2000. 另外，二抗的稀釋倍數(shù)也需要摸索嘛？ 再次感謝~~~ 期待回復(fù)~~^_^ |
8樓2011-05-20 23:36:44
happy-j
銀蟲 (小有名氣)
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2樓2011-05-18 21:37:46
314300420
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lstt09nk(金幣+6): 感謝參與，歡迎常來 2011-05-19 13:37:07
happy-j(金幣+1): 第一次發(fā)帖求助，非常感謝提供解決意見。 2011-05-19 20:29:08
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happy-j(金幣+1): 第一次發(fā)帖求助，非常感謝提供解決意見。 2011-05-19 20:29:08
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內(nèi)參的抗體是不是回收使用了？現(xiàn)在天氣比較熱，抗體容易失活效價(jià)變低，而且會(huì)產(chǎn)生雜點(diǎn)和高背景，建議不要回收。根據(jù)你內(nèi)參的結(jié)果分析，主要原因就是熒光強(qiáng)度低，可提高抗體濃度，另外使用的發(fā)光液的敏感性很重要，好的ECL發(fā)光液可以節(jié)省抗體，降低背景值，Millipore的效果很不錯(cuò)（貨號(hào)WBKLS0500）。 第二張圖的結(jié)果，分析認(rèn)為是上樣量過大，100ug/泳道，已經(jīng)過載，超過了凝膠的分辨率，相鄰孔的蛋白已經(jīng)連在一起了，效果和沒有梳子是一樣的。你可以看看100ug的上樣量，考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果是什么樣的，再對(duì)比下20ug的上樣量是什么效果。 |
3樓2011-05-19 09:41:41
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4樓2011-05-19 11:33:40
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