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30937747木蟲 (小有名氣)
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[求助]
[求助]高保真酶擴(kuò)不出來
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| 我提取RNA做反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板做PCR,用普通taq酶擴(kuò)出來的片段很亮,而且專一性很好,但是換高保真酶都擴(kuò)不出來,換了兩種酶,溫度梯度和濃度梯度都做了,延伸的時(shí)間也增長了一倍.但是就是沒有結(jié)果,請(qǐng)問有什么好的建議嗎? |
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6樓2011-06-09 10:32:29
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
rainwander(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金幣+4): 非常感謝,但是有一個(gè)問題是,我的序列是未知的,所以才做反轉(zhuǎn)錄,所以我無法確定是否突變.才必須要用高保真酶.請(qǐng)問哪種taq酶比較好? 2011-06-07 07:20:18
rainwander(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金幣+4): 非常感謝,但是有一個(gè)問題是,我的序列是未知的,所以才做反轉(zhuǎn)錄,所以我無法確定是否突變.才必須要用高保真酶.請(qǐng)問哪種taq酶比較好? 2011-06-07 07:20:18
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樓主是想做一些基因下游實(shí)驗(yàn)吧，Taq酶的活性確實(shí)要比高保真酶的活性強(qiáng)，這是公認(rèn)的。鑒于這種情況，給你兩種可供選擇的Protocol： 1，若果你的目的片段不大，1-2.5kb，可以先用好一點(diǎn)的Taq酶擴(kuò)增了，上質(zhì)粒，測(cè)序沒有突變后，然后再用pfu酶或Phusion等高保真酶進(jìn)行亞克隆； 2、如果樓主覺得上面這個(gè)方案麻煩，你可以在你的高保真酶中加入少量的高質(zhì)量的Taq酶，記住是質(zhì)量好的Taq酶，然后參照高保真酶的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，也許這可以解決你的問題 Bless you！ |
2樓2011-06-05 22:11:54
phyllislhy
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 9 (幼兒園)
- 金幣: 2070.6
- 紅花: 2
- 帖子: 411
- 在線: 64.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 105582
- 注冊(cè): 2005-11-16
- 性別: MM
- 專業(yè): 微生物資源與分類學(xué)
3樓2011-06-07 12:44:34
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
rainwander(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金幣+2): 是昆蟲的,我搜過了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
rainwander(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金幣+2): 是昆蟲的,我搜過了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
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"我的序列是未知的,所以才做反轉(zhuǎn)錄,所以我無法確定是否突變.才必須要用高保真酶.請(qǐng)問哪種taq酶比較好?" 你的序列是未知的是指不知道是什么微生物，還是不知道這個(gè)“微生物分離株”的特有序列，如果是前者，你可以用先用一般的taq酶（可以找promega或invitrogen公司的不錯(cuò)）進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，在根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)特異性引物去擴(kuò)增，這時(shí)候就可以選用高保真酶（前面提到的幾個(gè)公司都有，但價(jià)錢比較貴），不過都是pfu酶及其衍生系列。如果知道是什么微生物，就可以根據(jù)該屬的微生物已上傳的序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增。后面這種情況會(huì)順利很多。 |
4樓2011-06-07 21:18:17
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