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pumpkin236鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
SIRNA
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各位前輩 我最近開始做基因沉默，沉默的是NIH3T3細(xì)胞系的sep15基因，但是用RT-PCR檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默效率為0，不知道是怎么回事，所以請(qǐng)大家?guī)臀铱匆幌?br /> 1 siRNA序列的選擇 我參考的是一篇文獻(xiàn)，下面 The following Stealth RNA interference (RNAi) duplexes (Invitrogen, Carlsbad, CA) were used: Sep15, UCCUGAGCGAGAAGUUGGAACGCAU; 文獻(xiàn)給的是sep15的RNA單鏈，是不就是給的miRNA序列，（看到一個(gè)帖子介紹了miRNA和siRNA的區(qū)別，說miRNA是單鏈，siRNA是雙鏈）？ 我直接按堿基配對(duì)原則，配對(duì)成了雙鏈的RNA。當(dāng)做siRNA。讓公司合成 但是現(xiàn)在沉默效率為0.不知道是本身siRNA序列合成錯(cuò)誤還是其他原因 2 使用的轉(zhuǎn)染試劑是lipo2000 步驟如下 ①① 以合適的密度接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，在轉(zhuǎn)染的前一直用10％新生小牛血清而無雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到80％融合時(shí)，換用無血清無雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)并進(jìn)行轉(zhuǎn)染； ②② 對(duì)于需要轉(zhuǎn)染的每孔細(xì)胞，用250μl的DMEM無血清培養(yǎng)基來稀釋5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量為100pmol）； ③③ 用250μl的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基來稀釋5μl的Lipofectamine2000； ④④ 一旦Lipofectamine2000被DMEM稀釋，5分鐘內(nèi)將稀釋的siRNA引物（步驟2）和稀釋的lipofectamine2000（步驟3）混合均勻，在在室溫下孵育20min促使siRNA引物與lipofectamine2000混合物的形成； ⑤⑤ 孵育完成后，直接往每孔中加入siRNA引物與lipofectamine2000混合物500μl，補(bǔ)足無血清培無雙抗培養(yǎng)基至2000μl，并輕輕搖晃培養(yǎng)板使其混勻； ⑥⑥ 轉(zhuǎn)染24h后，可檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)或加藥進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題 1轉(zhuǎn)染前細(xì)胞狀態(tài)較好，但是轉(zhuǎn)染后6h去觀察，發(fā)現(xiàn)有部分細(xì)胞死亡，而且背景有很多小黑點(diǎn)，24h觀察，有很多成團(tuán)的漂浮物。死細(xì)胞不像，如果是染菌了，但是我操作已經(jīng)很小心，實(shí)驗(yàn)也重復(fù)了三次，三次都是到轉(zhuǎn)染后才出發(fā)好多漂浮物。 2用RT-PCR檢驗(yàn)，沉默效率為0，郁悶死了。大家檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率是用wb，還是PCR 3大家都用的什么轉(zhuǎn)染試劑 4 不知道是不是我的siRNA序列選擇錯(cuò)誤。siRNA可以用miRNA按照堿基配對(duì)方法合成不 在線等答案 謝謝了 |
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木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-06-16 22:00:48
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-17 13:13:47
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:32
lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-06-16 22:00:48
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-17 13:13:47
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:32
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細(xì)胞死亡太多，可能和轉(zhuǎn)染試劑以及細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，你應(yīng)該會(huì)做一個(gè)陰性的FAM標(biāo)記的轉(zhuǎn)染對(duì)照，看一下在這個(gè)過程中轉(zhuǎn)染效率以及siRNA是否穩(wěn)定，另最好做一個(gè)beta－actin siRNA的陽性對(duì)照。如果是rt－PCR檢測(cè)的最好是24-48小時(shí)抽提，如果做wb，可以48-72小時(shí)抽提。 很久不玩了，只有這些建議。 |
4樓2011-06-15 10:21:08
zhuqiushi
至尊木蟲 (正式寫手)
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lstt09nk(金幣+2): 熱心 2011-06-16 21:59:56
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給樓主一個(gè)做RNA干擾的公司（武漢晶賽）的網(wǎng)址吧，上面有一些做RNA干擾的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29 另外，我們以前做RNA干擾的時(shí)候都是至少設(shè)計(jì)兩條siRNA；再另外，你們做RT-PCR的時(shí)候有沒有先做一個(gè)時(shí)間梯度的摸索，其他還木有想到（好久木有做了） |
2樓2011-06-15 07:22:11
silicare
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【答案】應(yīng)助回帖
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lstt09nk(金幣+5): 你會(huì)的還挺多的么 2011-06-16 22:00:16
pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:25
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pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:22:26
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siRNA不好做，對(duì)于新手可以選擇更好控制的shRNA，shRNA是雙鏈DNA構(gòu)建載體，比較好操作 干擾序列一般要選3段，不建議自己設(shè)計(jì)，成功率低，你可以到NCBI 的探針庫去找，或者查文獻(xiàn)找現(xiàn)成的 lipo2000的毒性眾所周知，漂細(xì)胞也在所難免 ps lipo的假貨很多，最好原裝 至于檢測(cè)，RT-PCR需要做熒光定量才行，WB也可以，不過時(shí)間點(diǎn)一定要控制好，早了不干擾，晚了干擾過了又回復(fù)了，畢竟他不能整合 |
3樓2011-06-15 08:25:36
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木蟲 (著名寫手)
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5樓2011-06-15 10:21:59
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