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RQYLICHEE新蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
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最近做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)總是不成功。我的具體方法是： 1. 取100μl 感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化。 2. 加入1μl 純質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，冰浴30 min。 3. 將菌液放入42℃水浴中熱激90 秒，立即放入冰浴中2 min。 4. 加入0.9ml LB液體（提前37℃預(yù)熱），于37℃恒溫?fù)u床上200rpm×50min 溫育。 5. 將菌液5000rpm/min 離心5min，留200μl上清將菌體打散，均勻涂布于含適當(dāng) 抗生素的瓊脂平板表面（已提前涂布好抗生素，并預(yù)熱），平板于37℃倒置培養(yǎng)過夜。 我的質(zhì)粒（別人贈(zèng)送）是PET-28a，質(zhì)�；蛏嫌蠩coRI及NheI酶切位點(diǎn)。但我的實(shí)驗(yàn)用不到酶切位點(diǎn)，只是要用里面的基因，所以我就沒管酶切位點(diǎn)。再就是抗生素，因?yàn)镻ET-28a是卡那霉素抗性。我就先配成10mg/mL母液，置于-20℃保存。使用時(shí)再稀釋成50ug/mL的工作液濃度。由于技術(shù)水平有限，我是將平板準(zhǔn)備好后，在上面涂80uL的抗生素（50ug/mL）。 以上就是我的實(shí)驗(yàn)流程。但是我轉(zhuǎn)了幾次，只有第一次出現(xiàn)單菌落，其余幾次都沒有單菌落。在沒有出現(xiàn)單菌落的情況下，我想試試是不是有菌產(chǎn)生，就把菌挑到LB液體中培養(yǎng)，但沒有培養(yǎng)成功。 懇請(qǐng)各位高手指教！ |
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beautybanana
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【答案】應(yīng)助回帖
RQYLICHEE(金幣+1): 2011-06-16 19:16:08
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我把我以前做的轉(zhuǎn)化步驟給你參考下，一般都會(huì)成功的~ (1) 將10μL連接液移入含200μL感受態(tài)細(xì)胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。y一般是45min (2) 42℃水浴熱激90sec后，立即再冰浴5min。 (3) 加入300μL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 rpm培養(yǎng)1-2h。一般是2小時(shí) (4)吸100μL菌液涂布含Amp（1ulAmp/ml培養(yǎng)基）平板培養(yǎng)基的LB固體培養(yǎng)基平板， 37℃ 培養(yǎng)16－24h。 |
8樓2011-06-15 23:18:10
yabxxh
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-15 19:35:28
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-15 19:35:28
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你這個(gè)情況有兩個(gè)地方是有問題的，但是別擔(dān)心，誰(shuí)不是從不會(huì)到會(huì)的。 首先，轉(zhuǎn)化方法沒有問題，但是你最后離心用的5000rpm，個(gè)人感覺有點(diǎn)偏高，可以降至2500rpm，1min。 其次，你的板。為什么說自己技術(shù)水平有限呢，別人能做到的，你也一定能。如果你堅(jiān)持不相信自己，請(qǐng)把你的抗生素稀釋10倍。 好運(yùn)。 |
2樓2011-06-15 13:29:48
lxj341401
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3樓2011-06-15 13:31:12
天使托
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-15 19:33:44
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-15 19:33:44
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怎么做個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化涂布這么麻煩； 直接將2ul質(zhì)粒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)60-70ul感受態(tài)細(xì)胞中（電轉(zhuǎn)）；然后用SOC培養(yǎng)基吹吸菌液，然后將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，搖床中搖1h，取出后取100-150ul菌液涂布在相應(yīng)抗生素的板子上就可以。。。 第二天，一般18--24h挑板子上的單克隆進(jìn)行驗(yàn)證就可以了。。。 |
4樓2011-06-15 15:44:31
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