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lyd0311銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
雞肝中氯霉素檢測(cè)為何出現(xiàn)假陽性？（ELISA檢測(cè)） 已有3人參與
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本人從事食品殘留監(jiān)測(cè)工作，從業(yè)時(shí)間半年。最近做雞肝中氯霉素檢測(cè)項(xiàng)目遇到些無法解釋的問題，現(xiàn)把我個(gè)人總結(jié)與分析同大家分享，跪求專業(yè)人士參與討論，指點(diǎn)迷津。 我所用的方法是間接競爭ELISA（望爾公司氯霉素檢測(cè)試劑盒）共進(jìn)行41批樣品的檢測(cè)（這些樣品來自于不同地市）。檢測(cè)結(jié)果前21陰性（1-21號(hào)，后20批陽性（21-41號(hào)），按照以往的經(jīng)驗(yàn)分析絕對(duì)不可能出現(xiàn)如此多的陽性，于是對(duì)20批陽性復(fù)檢，均為陰性。 分析原因：因?yàn)闄z測(cè)試劑盒為新購置，在保質(zhì)期內(nèi)，而且陰性/陽性結(jié)果分布規(guī)律，同一排ELISA孔出現(xiàn)兩種不同結(jié)果（同一列，前3排孔為陰性，后5排孔為陽性），因此我排除了試劑盒質(zhì)量問題，也排除ELISA檢測(cè)過程操作問題，我認(rèn)為問題應(yīng)該出現(xiàn)在樣品前處理步驟。 雞肝中氯霉素樣品前處理步驟較為簡單，稱3g雞肝勻漿，6mL乙酸乙酯提取，振蕩10m，離心10m，取4ml上清，氮?dú)獯蹈桑?ml正己烷懸起，加1ml復(fù)溶工作液（公司提供）渦旋振蕩30s，離心15m，棄上層，下層備用。如此簡單的步驟竟然出現(xiàn)問題，實(shí)在汗顏。我分析原因，按照我的理解將各步驟逐一分析，此處需請(qǐng)各位專家指證。 1、 現(xiàn)將稱取振蕩離心吹干等步驟省略（安全按照說明說時(shí)間操作），因這些步驟不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生直接影響。 2、 6ml乙酸乙酯。我排除此步驟原因有三：首先我操作時(shí)使用的色譜純，純度高于分析純，純度高于實(shí)驗(yàn)所需，且該瓶溶液已經(jīng)用于其他實(shí)驗(yàn)操作結(jié)果正確，排除乙酸乙酯質(zhì)量問題。二，回憶當(dāng)初操作步驟，因乙酸乙酯有特殊的香味，應(yīng)當(dāng)不會(huì)加錯(cuò)。三，退一步說即使當(dāng)時(shí)我加的不是乙酸乙酯，因不會(huì)出現(xiàn)陽性結(jié)果而應(yīng)該是陰性。因此我分析問題不出現(xiàn)在此步驟。 3、 正己烷懸起。我個(gè)人理解，正己烷的作用是除去雞肝中脂肪，防止脂肪對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。當(dāng)時(shí)為保險(xiǎn)起見我將添加量加倍，用2ml懸起渦旋。如果此步驟出現(xiàn)問題，雞肝中脂肪未除去，確實(shí)會(huì)產(chǎn)生假陽性的可能。 4、 加復(fù)溶工作液1ml。我請(qǐng)教過同事，說復(fù)溶液是緩沖液，作用是調(diào)節(jié)ph，我不知道公司所帶的復(fù)溶液成分，我想應(yīng)該是以水為主的液體，或許兼有調(diào)節(jié)ph作用，因試劑盒要求，復(fù)溶液同時(shí)也用作稀釋抗體工作液用。公司所給復(fù)溶液需2倍稀釋，按我的印象此步驟沒有問題。但還是對(duì)此做了分析，排除原因有以下幾點(diǎn)：一、有人質(zhì)疑我誤將洗滌液當(dāng)復(fù)溶液加入，我想洗滌液作用應(yīng)該是封閉EILSA中為結(jié)合的抗原抗體位點(diǎn)，如果加入的洗滌液，其ELISA反應(yīng)將不會(huì)進(jìn)行，也不會(huì)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，應(yīng)該是陰性結(jié)果吧。二、公司所提供40ml洗液，我配置了400ml洗液，按照20*稀釋比例我用了20ml濃縮洗液，我量取了剩余洗液仍為20ml，因此不會(huì)出現(xiàn)誤用洗液當(dāng)復(fù)溶液的錯(cuò)誤。 基于以上四點(diǎn)我將錯(cuò)誤焦點(diǎn)鎖在正己烷上。有的同事說我正己烷加錯(cuò)了，但我個(gè)人認(rèn)為我沒有加錯(cuò)，因?yàn)楫?dāng)時(shí)通風(fēng)櫥操作區(qū)內(nèi)只有一瓶500ml棕色瓶，我當(dāng)時(shí)按每個(gè)樣品2ml加入，加入正己烷懸起后正己烷呈黃色，離心后在液體上層，我吸出后留取下層溶液備用，且吸取時(shí)味道確為正己烷。下層備用溶液為無色透明。各種跡象表明我沒用加錯(cuò)，確實(shí)為正己烷。為了驗(yàn)證此溶液是否失效，我在重新處理時(shí)仍有數(shù)個(gè)樣品使用該瓶正己烷，結(jié)果正常。因此可排除正己烷失效或拿錯(cuò)的可能。不知道我的分析是否正確，既然我排除了所有的可能，但20批樣品的假陽性確實(shí)出現(xiàn)，我實(shí)在分析不出原因，所以發(fā)此貼請(qǐng)各位專家指點(diǎn)。 另外還有個(gè)可能，我使用的燒杯或大槍頭被氯霉素污染。因?yàn)樵谖易鰧?shí)驗(yàn)之前其他同事做過農(nóng)業(yè)部比對(duì)項(xiàng)目，其中有氯霉素檢測(cè)項(xiàng)目。但無法確定，此原因暫不討論。是否還有其他我未想到的原因或我理解錯(cuò)誤的情況，也請(qǐng)指點(diǎn)。 |
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3樓2011-07-02 23:47:13
lyd0311
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5樓2011-07-03 18:19:00
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