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yesucao木蟲 (正式寫手)
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[求助]
載體連接
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我的實(shí)驗(yàn)情況如下： 1、目的基因片段和表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，割膠回收，跑膠驗(yàn)證，晚上進(jìn)行連接；（回收的大小沒有問題） 2、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a； 3、轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證目的片段的大��；（條帶大小正確） 4、挑取轉(zhuǎn)化子搖菌、提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，（這個(gè)時(shí)候出現(xiàn)問題了） 問題如下： 1、重組質(zhì)粒雙酶切顯示：目的基因的片段大小正確 720bp，但是載體大片段的大小只有3500bp，按理說的話載體的大片段有5500bp左右的； 2、重組質(zhì)粒單酶切顯示：條帶大小顯示在3500-5500之間；（似乎和雙酶切兩條片段的大小之和一致） 按照重組質(zhì)粒的單、雙酶切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在提質(zhì)粒、酶切上實(shí)驗(yàn)沒有問題，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)本身也沒有問題，難道是我連接有問題？？？ 我的連接體系： 目的片段 12微升 載體 4微升 T4 2微升 Buffer 2微升 |
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2樓2011-07-01 17:24:19
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3樓2011-07-01 17:49:31
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
yesucao(金幣+3): 我也是打算重新做的，只是想知道自己到底會(huì)在那個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題 2011-07-01 18:50:21
dhd997(金幣+3): 2011-07-01 19:29:07
yesucao(金幣+3): 我也是打算重新做的，只是想知道自己到底會(huì)在那個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題 2011-07-01 18:50:21
dhd997(金幣+3): 2011-07-01 19:29:07
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不是你連接的問題； 其實(shí)第一個(gè)問題和第二個(gè)應(yīng)該是一個(gè)問題，你確定你的載體沒有什么問題，在你連接前，酶切純化載體后的大小是多少？5500bp嗎？ 然后你連接之后酶切驗(yàn)證時(shí)，酶切下來載體就變成3500bp了？確實(shí)挺奇怪的，我從來沒有遇到過著怎樣的問題！ 重復(fù)了嗎？ |
4樓2011-07-01 17:54:22
5樓2011-07-03 10:24:11
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
dhd997(金幣+2): good 2011-07-03 18:09:37
yesucao(金幣+2): 2011-07-04 12:21:47
dhd997(金幣+2): good 2011-07-03 18:09:37
yesucao(金幣+2): 2011-07-04 12:21:47
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可能的原因是你選擇的內(nèi)切酶在載體上有可以識(shí)別的切割位點(diǎn)，即內(nèi)切酶把你的載體給切斷了，所以在連接后載體片段會(huì)變小。 建議：核對(duì)內(nèi)切酶表，確認(rèn)載體上沒有可被識(shí)別的切割位點(diǎn)。但是內(nèi)切酶表有時(shí)候也不可靠，所以要想最終搞清楚原因只能以載體序列為目標(biāo)，設(shè)計(jì)引物，測序，看一下載體序列是否有缺失。 如果覺得這樣做太麻煩，只能換內(nèi)切酶。 |
6樓2011-07-03 11:03:31
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7樓2011-07-24 22:49:01
yesucao
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8樓2011-07-25 19:28:56
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