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[求助]
求助胞內(nèi)酶分離技術(shù)，離子交換
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| 采用梯度洗脫的方法，離子濃度梯度ph6.0。然后DEAE-52離子交換填料分離純化酶，柱高30cm，內(nèi)徑1cm，上樣量1.2ml。但是跑了3個(gè)小時(shí)也沒(méi)有峰。確保目標(biāo)酶存在于上樣溶液中。而且ph6.0不影響酶活。。。。。。我做這個(gè)酶做了好幾次了，采用葡聚糖凝膠G-100,200都試過(guò)也是沒(méi)有分離，要么一個(gè)峰，要么沒(méi)有峰。。。不知道咋回事，求助各位大俠了，在此謝過(guò)。 |
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2樓2011-07-01 22:17:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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scelab(金幣+5, EPI+1): 謝謝交流 2011-07-02 09:49:18
zhouhou(金幣+2): 好 2011-07-02 10:13:49
scelab(金幣+5, EPI+1): 謝謝交流 2011-07-02 09:49:18
zhouhou(金幣+2): 好 2011-07-02 10:13:49
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首先看看你的蛋白質(zhì)能不能被吸附，DEAE-52離子交換是弱陰離子交換，你選用pH6.0，那么你的目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)一定要低于6.0才能被吸附，確切地說(shuō)，要有0.5個(gè)pH值差別才能保證被吸附。 跑了3個(gè)小時(shí)都沒(méi)有蛋白質(zhì)峰，會(huì)不會(huì)是上樣的蛋白質(zhì)太少，少到儀器檢測(cè)不出差別的程度？因?yàn)?個(gè)小時(shí)過(guò)去了，才這么點(diǎn)柱床體積，都不知道洗了多少倍了，要出來(lái)早就出來(lái)了。還有可能是離子強(qiáng)度不夠強(qiáng)，不能洗脫這些蛋白質(zhì)，我用強(qiáng)陰HiPrep Q XL和其它弱陰、強(qiáng)陽(yáng)、弱陽(yáng)的時(shí)候最后都用2M氯化鈉去清洗的，有時(shí)也能洗下來(lái)一點(diǎn)點(diǎn)蛋白質(zhì)，你用來(lái)洗脫的離子強(qiáng)度可能不夠高。理論上，你的目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)離選用的pH值越遠(yuǎn)，解離的可用于交換吸附的基團(tuán)越多，與層析柱結(jié)合的程度越緊密，需要的洗脫的離子強(qiáng)度越大。順便說(shuō)一聲，0.5M的氫氧化鈉pH值可能達(dá)到13，對(duì)你的弱陰離子交換填料不好，如果你要用，那么洗脫時(shí)間別太長(zhǎng)。我還是建議你先用pH6.0的高濃度的氯化鈉來(lái)洗脫，實(shí)在不行才換用氫氧化鈉。 |
3樓2011-07-02 01:36:43
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