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mf2003

鐵蟲 (初入文壇)

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[求助] 限制酶SexAI的保護堿基和定向克隆問題

大家好：

請問限制酶SexAI的保護堿基怎么加？我打算加4個“Gs”，這樣可以么？SexAI的識別序列是ACCWGGT(W=A/T)。我準備用SexAI做定向克隆，所用載體上游SexAI序列是5‘-ACCAGGT-3’;，下游SexAI序列是5‘-ACCTGGT-3’;(同一條鏈上的序列，即都在sense strand上，即：5‘-ACCAGGT-------------ACCTGGT-3‘) ，那么我的上下游引物的酶切位點怎么加啊？是加不同序列的SexAI， 5’-ACCAGGT-3‘+上游引物，5’-ACCTGGT-3‘+下游引物？這樣好像無法連接到載體上，只能連接一頭。還是加相同序列的SexAI，即：5’-ACCAGGT-3‘+上游引物， 5’-ACCAGGT-3‘+下游引物？這樣的話插入片段就有可能以任意一個方向插入，即有兩種方向的插入片段。

用不同序列的SexAI可以直接進行連接么？因為質(zhì)粒雙酶切（質(zhì)粒上有兩個不同序列的SexAI位點），酶切后形成的質(zhì)粒兩頭的黏性末端是相同的（對么？原來這兩個SexAI位點之間的序列就丟失了？），所以插入基因可以以任意一種方向連接，都會出現(xiàn)方向不正確和方向正確的序列。我有點陷進去了，大家?guī)臀铱词遣皇菚a(chǎn)生兩種方向的插入序列啊。

說明：兩個SexAI位點分別位于質(zhì)粒的兩個MCS上，用的啟動子是PnisA，具體序列如下圖所示：

[ Last edited by mf2003 on 2011-7-15 at 10:11 ]

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1樓 2011-07-15 10:10:25

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