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maomao809920金蟲 (小有名氣)
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[求助]
RCR自己怎么都做不出來，但是同樣條件下師哥幫著做了，卻出來了，求助原因
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最近在做PCR，新手一枚，跨專業(yè)到生物化學(xué)專業(yè)。。 師哥指導(dǎo)下做了PCR，之后跑了電泳，但是什么都沒有。 然后師哥自己做了一遍（同樣的藥品、儀器、體系），電泳后就有條帶了。。 之后自己又做了一遍，依舊沒有，很桑心。想知道為什么。。 分析了一下，覺得應(yīng)該是自己使用移液槍加樣的不規(guī)范導(dǎo)致的，在加樣的時候應(yīng)該注意什么，是不是每次加樣的時候，槍頭都要深入至小離心管管底？ 求各位大俠指導(dǎo)了，是不是我操作有問題。。 先謝謝了！ |
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2樓2011-07-17 19:00:41
dhd997
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3樓2011-07-17 20:06:51
maomao809920
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4樓2011-07-17 21:53:39
maomao809920
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5樓2011-07-17 21:58:12
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6樓2011-07-18 00:36:48
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5): good 2011-07-18 12:46:32
dhd997(EPI+1): 沒仔細(xì)看 2011-07-18 12:47:24
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dhd997(EPI+1): 沒仔細(xì)看 2011-07-18 12:47:24
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新手呀，沒有做出來很正常的；慢慢來就可以很隨意的； PCR這個東西呢，首先你得先搞清楚原理是什么，就是體系中各個樣品是干什么的，這個必須清楚，不要等做過很多PCR了，才發(fā)現(xiàn)里面什么東西是干什么的都不知道，就悲催了； 首先呢，體系呢，小到10ul，大到100--200都有的，不同目的，不一樣的體系； 體系中有什么呢？去離子水 模板 引物（sense antisense） 酶 Buffer dNTP 一般就這六種，有時候還會添加甘油，DMSO KCL； 還有就是操作的時候，一定要細(xì)心認(rèn)真，因為加的量都比較小，所以要用準(zhǔn)確一點的移液槍，稍有不慎就會多加或者少加，所以這一步很重要滴； 下來就是程序的設(shè)計了，主要需要注意的是退火溫度和延伸時間的選擇了，不同目的不一樣的，慢慢做就會很隨意的。 加油！祝福ing  |
7樓2011-07-18 12:45:06
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8樓2011-07-18 14:13:15
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9樓2011-07-18 14:45:15
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5, EPI+1): Good！不改專家本色哦！ 2011-07-19 16:31:05
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good！不改專家本色哦！ 2011-07-19 16:31:05
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同樣的條件，熟練的人可以做出來，生手不一定能做的出來，對于新手來說，一般都是加樣的問題，很難將少至于0.幾ul 的樣品加準(zhǔn)確，這個最好用移液槍吸水打到PCR管中來聯(lián)系，在熟練人員的指導(dǎo)下，看0.2ul在槍頭什么位置，0.5ul在槍頭什么位置，2ul在槍頭什么位置（一般來說，同樣型號的槍頭規(guī)格差別不大）相同體積的液體所在槍頭的位置大致相同，這樣吸取多少樣做到心中有數(shù)，拿移液槍時，右手拿槍，左手的食指或中指（一個指頭就可以）輕輕壓著移液槍的中部位置（大概位置）這樣加樣的時候在2個手的作用下會更平衡些，加到PCR管中的時候輕輕的靠近管壁打下去，使打下去的液體成為一個點，每次加樣的時候，在靠近上次加樣（那個液體點）附近再打下去也是一個點，點與點之間保持一定的距離，這樣你加幾個樣就會有幾個點，不會使你混亂的，最后加水的時候可以把各個點稍微沖下去就好了，點動離心一下液體都會下去混勻了。新手要多練加樣技術(shù)，可以拿空白的水作為PCR的各種成分加樣，多多練習(xí)必然會熟練的。 |
10樓2011-07-18 20:55:03
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