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追尋風(fēng)輕揚金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重疊延伸 ，為什么用連接后的片段作為模板卻擴(kuò)不出來？
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| 煩請各位幫幫忙 兩個外顯子 200bp 和1000bp的 重疊延伸pcr擴(kuò)出1200的 膠回收后 用1200的作為模板 卻擴(kuò)不出來了 而且還有一條250左右的片段 為什么啊 ？問題可能出在哪兒呢？ |
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追尋風(fēng)輕揚
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11樓2011-08-21 17:31:39
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
dhd997(金幣+3): good 2011-07-24 09:13:01
dhd997(金幣+3): good 2011-07-24 09:13:01
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PCR擴(kuò)不出來，可以降低退火溫度試試。 不過如果用原來擴(kuò)增200bp和1000bp的引物來擴(kuò)1200bp的引物，一般比較難，原理我不記得了。 我們一般這樣子做：當(dāng)初擴(kuò)你那兩個片段的時候（姑且稱為A片段和B片段，A在左B在右），A的左端和B的右端額外多擴(kuò)幾個到幾十個堿基；另外再設(shè)計一對嵌套引物，位點就在你需要的A的左端和B的右端，用它來擴(kuò)增融合產(chǎn)物，得到你真正需要的產(chǎn)物。一句話，就是融合時使得融合產(chǎn)物比想要的產(chǎn)物長一點，之后再用一對新的引物把目的產(chǎn)物P出來。 |
2樓2011-07-23 17:10:54
追尋風(fēng)輕揚
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3樓2011-07-26 22:12:13
4樓2011-07-26 22:44:54
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