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追尋風(fēng)輕揚(yáng)金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
重疊延伸 ,為什么用連接后的片段作為模板卻擴(kuò)不出來(lái)?
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| 煩請(qǐng)各位幫幫忙 兩個(gè)外顯子 200bp 和1000bp的 重疊延伸pcr擴(kuò)出1200的 膠回收后 用1200的作為模板 卻擴(kuò)不出來(lái)了 而且還有一條250左右的片段 為什么啊 ?問(wèn)題可能出在哪兒呢? |

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
榮譽(yù)版主 (知名作家)
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PCR擴(kuò)不出來(lái),可以降低退火溫度試試。 不過(guò)如果用原來(lái)擴(kuò)增200bp和1000bp的引物來(lái)擴(kuò)1200bp的引物,一般比較難,原理我不記得了。 我們一般這樣子做:當(dāng)初擴(kuò)你那兩個(gè)片段的時(shí)候(姑且稱為A片段和B片段,A在左B在右),A的左端和B的右端額外多擴(kuò)幾個(gè)到幾十個(gè)堿基;另外再設(shè)計(jì)一對(duì)嵌套引物,位點(diǎn)就在你需要的A的左端和B的右端,用它來(lái)擴(kuò)增融合產(chǎn)物,得到你真正需要的產(chǎn)物。一句話,就是融合時(shí)使得融合產(chǎn)物比想要的產(chǎn)物長(zhǎng)一點(diǎn),之后再用一對(duì)新的引物把目的產(chǎn)物P出來(lái)。 |
金蟲(chóng) (小有名氣)


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