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qinhw037鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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[求助]
細(xì)胞毒性的相關(guān)研究方法-----求助！跪請(qǐng)大家?guī)兔Γ?
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由于想做關(guān)于有機(jī)物對(duì)人或者魚(yú)細(xì)胞毒性的研究，但是本人是第一次接觸細(xì)胞毒性，因此想了解下測(cè)定細(xì)胞毒性的方法都有哪些，除了傳統(tǒng)的MTT 和流失細(xì)胞術(shù)，還有哪些比較常用的方法，基本原理和操作步驟最好也能有。 要是能有這方面相關(guān)的文獻(xiàn)綜述最好了，麻煩傳給我一份，謝謝您！ 有某一中具體方法的介紹文章發(fā)給我也謝謝！ 跪求大俠們幫忙！ |
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l-c-l
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- PhEPI: 1
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- 專(zhuān)業(yè): 腫瘤免疫
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
jiangchunyong(金幣+1): 謝謝 2011-07-26 13:21:27
中藥2000(金幣+5): 謝謝應(yīng)助。 2011-07-26 13:56:32
qinhw037(金幣+3): 謝謝 2011-07-26 17:57:19
qinhw037(金幣+7): 2011-08-02 14:32:43
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qinhw037(金幣+7): 2011-08-02 14:32:43
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這個(gè)范圍太大了，現(xiàn)在有很多方法，CCK-8 Assay，XTT法，SRB法和集落形成實(shí)驗(yàn)（比較鼓勵(lì)使用）.當(dāng)然還有一些像3H-tdR摻入，Ci51釋放實(shí)驗(yàn)，ATP-生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)等，有條件也可以考慮。 最廣泛應(yīng)用的是MTT和SRB法，多花錢(qián)的話(huà)可以考慮CCK-8（同仁化學(xué)）替代MTT法，優(yōu)點(diǎn)很多。 以SRB 實(shí)驗(yàn)為例，大概步驟： 1. 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化（懸浮細(xì)胞無(wú)需胰酶消化）后收集細(xì)胞，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10%牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至所需濃度，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液180μl，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型及實(shí)驗(yàn)周期選擇細(xì)胞數(shù)1000-40000個(gè)/孔左右。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-24h。 2. 每孔添加20μl體積的藥物，使每孔的總體積為200μl，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所要求的給藥時(shí)間。 3. 細(xì)胞的固定操作方法根據(jù)細(xì)胞是否貼壁及貼壁程度而有所不同。 貼壁細(xì)胞：終止培養(yǎng)后，棄去上清；每孔添加200μl PBS溶液，然后緩慢加入50μl 預(yù)冷的50%三氯乙酸溶液（TCA），使得每孔TCA終濃度為10%，細(xì)胞不同，使用TCA濃度也會(huì)有所不同。 半貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞：每孔直接添加50μl 濃度為80%的TCA溶液。 添加TCA后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于4℃固定處理1h。 4. 固定結(jié)束后，棄去上清培養(yǎng)液，用蒸餾水沖洗培養(yǎng)板4-5次，置于室溫晾干。 5. 每孔加入100μl SRB溶液，進(jìn)行染色處理10min-30min。 6. 染色結(jié)束后每孔加入適量1%的乙酸溶液進(jìn)行清洗，以除去未結(jié)合的SRB，反復(fù)處理5次。并于室溫下晾干。 7. 每孔加入100μl-200μl 濃度為10mM的Tris base溶液（pH 10.5）后，振蕩培養(yǎng)板10-30min，以使特異結(jié)合的SRB完全溶解。 8. 將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中，564nm處測(cè)OD值。 9. 結(jié)果處理。利用以下計(jì)算方法計(jì)算細(xì)胞抑制率 （a） 若實(shí)驗(yàn)組OD平均值大于或等于該組Day 0的OD值， % of control cell growth=(mean ODsample- mean ODday0)/ (mean ODcontrol- mean ODday0)×100% （b） 若實(shí)驗(yàn)組OD平均值小于該組Day 0的OD值，% of control cell growth = (mean ODsample- mean ODday0)/ mean ODday0×100% % 抑制率 = 100 − % of control cell growth Reference: Vanicha Vichai and Kanyawim Kirtikara. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nature Protocols. (2006),1: 1112 – 1116 |
2樓2011-07-26 11:14:13
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