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lizhijiang木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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生物實(shí)驗(yàn)常用試劑
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Western blot 準(zhǔn)備 一般準(zhǔn)備 1．雙蒸水 2．瓶子（500ml、250ml），離心管 3．tip頭 4．Eppendorf管 5．濾紙，餐巾紙 6．小針筒 7．微量加樣器20-50μl 8．勻漿器 二 裂解液 1．配胞漿裂解液（100ml，4℃） 10mM HEPES PH7.9 238.4mg 10Mm KCL 74.5 mg 0.5mM DTT 7.7 mg (臨時(shí)加，1M DTT，49.8μl) 0.2mM PMSF(有毒) 3.4 mg (臨時(shí)加，100mM PMSF，195.4μl) 苯甲基磺酰氟（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶） 0.1mM EDTA（292.2） 2.9 mg (臨時(shí)加，0.5M EDTA 19.8μl) 0.1mM EGTA（380.35） 3.8 mg 配好后KOH或 NaOH定至PH7.9 （配1M DTT，1ml, 154.25mg粉劑加雙蒸水至1ml） （配100mM PMSF，1ml, 17.42mg粉劑加異丙醇至1ml） （配0.5M EDTA，1.4615g 不含水EDTA-Na 加 8ml水，很難溶，加NaOH調(diào)PH，即易溶，定容至10ml) （配胞漿裂解液，10ml，臨時(shí)加1M DTT 4.98μl，臨時(shí)加100mM PMSF 19.54μl，臨時(shí)加，0.5M EDTA 1.98μl 2．配胞核裂解液，8M，尿素 20ml 9.6096g 尿素 加水 20ml 三 BCA法測(cè)蛋白濃度 (新的96孔板細(xì)胞室用) 196μl，3.92μl，10μlsample（1μlsample，9μl水） 九個(gè)ependorf，編號(hào) Volume of diluent Volume and source of BSA Final BSA Concentration A 0 300μl of stock 2000μg/ml B 125μl 375μl of stock 1500μg/ml C 325μl 325μl of stock 1000μg/ml D 175μl 175μl of vial B dilution 750 μg/ml E 325μl 325μl of vial C dilution 500 μg/ml F 325μl 325μl of vial E dilution 250 μg/ml G 325μl 325μl of vial F dilution 125 μg/ml H 400μl 100μl of vial G dilution 25 μg/ml I 400μl 0 0 μg/ml=blank 1 ependorf 樣品編號(hào) 2 196μl“A”，3.92μl“B”，分別加入，96孔板每孔25μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品（樣品5μl，加水20μl），（樣品2.5μl，加水22.5μl）混勻30秒 3 蓋蓋，37℃，30m 4 恢復(fù)室溫，562nm讀，計(jì)算（樣品濃度乘5）（樣品濃度乘10） 四 配制溶液 1．丙烯酰胺存儲(chǔ)液300ml 通風(fēng)櫥 攪拌至溶解 4℃ 暗處（棕色瓶） 最長(zhǎng)一月 87.6g acrylamide丙烯酰胺(有毒，戴口罩，面罩) 2.4g 亞甲基丙烯酰胺 300ml 水 * 29.2g丙烯酰胺 0.8g亞甲基丙烯酰胺 100ml水） 2． 1.5M Tris-HCL,PH8.8，150ml，4℃ 27.23g Tris base 80ml 水 慢加濃鹽酸至PH8.8(約5ml) 加水至150ml 3．0.5M Tris-HCL,PH6.8，100ml，4℃ 6g Tris base 60ml 水 慢加濃鹽酸至PH6.8(約3ml) 加水至100ml 4．10％SDS w/v，100ml，室溫 10g SDS(戴口罩，面罩) 加水至100ml 5． 1%溴酚藍(lán)（w/v）(0.5％太淡) 100mg 溴酚藍(lán) 加水至10ml攪拌 6．sample buffer樣品緩沖液， 4℃ 7.1ml 水 2.5ml 0.5M Tris-HCL,PH6.8 5ml glycerol甘油(丙三醇92.09)，剪掉頭 4ml 10％SDS 0.4ml 1％bromphenol blue 溴酚藍(lán) 19ml Total volume（1ml ependorf 管分裝） 用前加50μl β-巰基乙醇至950μl sample buffer 7．10×電泳緩沖液，PH8.3，不要用酸或堿調(diào)PH，4℃ 30.3g (15.15) Tris base 144g (72) glycine甘氨酸 10g (5) SDS 加水至1000ml（500ml） 用前稀釋至1×（50ml，10×電泳緩沖液加450ml水中） 8． 10％APS 4℃ 數(shù)月（隔周新鮮配置） 0.5g ammomum persulfate 過(guò)硫酸銨(戴口罩，面罩) 5ml 水 9．TEMED，避光，4℃ 四 轉(zhuǎn)移緩沖液 2.9g 甘氨酸 39mmol/L 5.8g Tris base 48mmol/L 0.37g SDS 0.037％ 200ml 甲醇 20％ 加水至1L（4℃） 五．染色液 1．10×麗春紅存儲(chǔ)液 2g 麗春紅 30g 三氯乙酸 30g 磺基水楊酸 100ml 水 1份存儲(chǔ)液加9份水配成使用液水（1：10稀釋成使用液） 2．1×麗春紅使用液 0.2g 麗春紅 1ml 冰乙酸(冰醋酸) 定容 100ml 3．PBS(每次至少2L)， 配PBS，1L 8g NaCL 0.2g KCL 1.44g Na2HPO4（3.628g Na2HPO4. 12H2O） 0.24g KH2 PO4 NaOH(書(shū)上是HCL，實(shí)際用NaOH)調(diào)PH至7.4，加水至1L，高壓滅菌20分，保存于室溫 4．封閉液（臨時(shí)配5-10ml） TBS+BSA(2%,細(xì)胞室用（2gBSA于100ml中）（0.2gBSA于10ml中,夠一塊用，多點(diǎn)無(wú)妨） 5．漂洗液（臨時(shí)配） TBS 1L加0.5g（0.5ml液體）吐溫-20（質(zhì)量體積濃度, 粘稠，剪掉頭吸），0.05％ 500ml-------0.25g-0.25ml, 250ml ---0.125 ml, 200ml---0.1ml , 125ml -----0.0625ml 6．配一抗 A液：0.1mg + 1ml PBS （0.1mg/ml） B液：取A液0.1ml 加PBS 0.9ml (0.01mg/ml, 10μg/ml) 取B液 0.16ml 0.16ml* 10μg/ml=1.6μg 1.6μg/8ml=0.2μg/ml (可先加0.08ml-0.8μg-4ml封閉液) 冰上，取與膜大小相仿盒子，節(jié)約一抗及PBS；A液分裝為233μl，233μl，233μl，；B液用掉0.08ml，0.08ml，0.08ml，分裝為253μl(B1已用掉)，253μl（B2），253μl(B3)， 7．配二抗 8μl二抗加入8ml封閉液,1:1000(第一次7.5μl加入5ml,1:700) 4μl---4ml 胞漿蛋白提取 1 玻璃勻漿器干燥2-3h，100℃ 2 80℃組織于液氮中， 取胞漿裂解液 10ml，臨時(shí)加1M DTT 4.98μl，臨時(shí)加100mM PMSF 19.54μl，臨時(shí)加，0.5M EDTA 1.98μl 3 編號(hào)后，勻漿器于冰塊中，ependorf管于冰塊中，1ml裂解液于勻漿器 4 200mg組織于勻漿器中 5 冰外勻漿，否則易碎 5 冰上置15m，置ependorf管， 6 加NP-40（純的，很稠厚）每管6μl，混勻（Tip） 7 冰上置15m 8 離心機(jī)予離心置2℃，25000轉(zhuǎn)，15m 9 分裝上清，200-300μl每管，置-20℃（短期保存可4℃） 10 繼續(xù)核蛋白提取，加8M尿素0.5ml左右，大的tip保留，搗碎用，冰上20m 測(cè)蛋白濃度（BCA法，二喹啉甲酸） 1加樣于96孔板 2測(cè) 3計(jì)算 配膠 紗布無(wú)水酒精干燥玻璃板、梳子，量玻板的寬度 （50ml 10*電泳緩沖液加450ml水中；） 在距梳齒0.5cm或距玻板1.5cm處標(biāo)記(膠會(huì)收縮) 1配12％，1 5ml 4ml 8ml 12ml 水 1.7ml 1.36 2.72 4.08 丙烯酰胺 2ml 1.6 3.2 4.8 1.5M Tris-HCL 1.25 ml 1 2 3 10％SDS 50μl 40μl 80μl 120μl 10％APS 25μl 20μl 40μl 60μl TEMED 2.5μl 2μl 4μl 6μl 覆蓋水層1-5mm, 置30-45m,量分離膠的寬度，倒出，沖洗未聚合的丙烯酰胺，濾紙吸干（帶手套，切七張濾紙，四大（4.5cm-8.3cm）三小(4.4cm-8.2cm)，切膜(4.5cm-8.3cm) 2配5％積層膠，1塊， 2ml 4ml 6 ml 水 1.14ml 2.28ml 3.42 ml 丙烯酰胺 0.34 ml 0.68ml 1.02ml 0.5M Tris-HCL 0.5 ml 1 ml 1.5 ml 10％SDS 20μl 40μl 60μl 10％APS 10μl 20μl 30μl TEMED 2μl 4μl 6μl 插梳子，置30-45m，拔梳子，沖洗未聚合的丙烯酰胺，把凝膠固定于電泳裝置，加入1*電泳緩沖液，排出凝膠底部?jī)刹０彘g的氣泡（注射器彎90℃），不要預(yù)電泳，以免破壞緩沖系統(tǒng)的不連續(xù)性。 加樣（冰上） （事先算出要加的樣品緩沖液）（設(shè)定PCR100℃5m，或煤氣燒水煮沸）用前加50μl β-巰基乙醇至950μl sample buffer（5μl-95μl，10μl-190μl，15μl-285μl，20μl-380μl），sample buffer稀釋樣品（100μg總蛋白，至少50μg）至少1：2，總體積<25μl（30-45μl），約20μl（可用水試驗(yàn)一下），100℃5m,沖洗加樣孔，加樣，每加一個(gè)，水沖洗針管于餐巾紙。最外側(cè)加等量樣品緩沖液，避免邊緣效應(yīng)，或MARK加樣孔。 電泳 正負(fù)極正確連接，80v，30-45m(1h)，染料至積層膠底部，改120v，60m(2h) 取膠（帶手套，油脂阻礙蛋白轉(zhuǎn)膜） 備盒子，轉(zhuǎn)移液多一點(diǎn)，撬玻璃，浸濕一下，刮下最左邊的兩個(gè)加樣齒做標(biāo)記，玻璃作尺子，切積層膠，墊片挑下，搖，30m 電轉(zhuǎn)（帶手套，油脂阻礙蛋白轉(zhuǎn)膜） （紙，膜長(zhǎng)寬均比膠小1mm）備1張膜（浸30m）搖，紗布無(wú)水酒精干燥，玻板上，一張大濾紙浸濕放于凝膠切積層膠，6張濾紙，浸濕一張放置一張，大濾紙-膜-膠-紙(試管趕氣泡)，濾紙吸干，15v，30m，看電流 取膜，切硝酸纖維膜的左下角標(biāo)記 麗春紅 麗春紅洗一次，置麗春紅中搖，5-10m，水搖、沖、搖、沖，TBS漂洗數(shù)次，每次1-2m， 免疫 1．封閉液，搖1-3h或過(guò)夜，（蓋） 2．棄封閉液，TBS洗膜3次，棄TBS 3．加PBS，一抗至（先1:500,1：1000-3000變異大），搖1-3h，可過(guò)夜，（蓋） 4．棄一抗，漂洗液洗膜3次，每次10m，棄，（TBS洗膜3次，棄TBS） 5．加PBS，二抗至（1：1000-3000，8μl:8ml），搖1-3h，可過(guò)夜，（蓋） # 二抗：1：2000 2μl—4ml (第一次7.5μl加入5ml,1:700，2月28日) 1：4000 1μl—4ml 6．棄二抗，漂洗液洗膜3次，每次10m，棄，（TBS洗膜3次，棄TBS） 7．按膜面積0.1ml/cm2加入底物液（4.5*8.3＝37） C液4.9ml加0.1mlB液，(3.626ml---0.074ml) 8．浸顯色液2-3m(鑷子夾住膜去浸，不要將底物液直接倒于膜上)，水略為漂洗，轉(zhuǎn)入250PBS的托盤(pán)中 9．水沖，allow to air dry on a paper towel，日照褪去顏色 水試驗(yàn)分離膠，積層膠，加樣孔的體積 設(shè)置對(duì)照：1 不與靶蛋白反應(yīng)的抗體（免疫前血清或非相關(guān)單克隆抗體）2 樣品對(duì)照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品 1．按膜面積0.1ml/cm2加入封閉液（4.5*8.3＝37----3.7ml），置平緩搖動(dòng)床上1-2h 2．棄封閉液，立即加入封閉液和適量一抗 3．按膜面積0.1ml/cm2加入封閉液和適量一抗，置平緩搖動(dòng)床上2h（非特異性結(jié)合背景是溫育時(shí)間和溫度的函數(shù)，延長(zhǎng)時(shí)間和提高溫度都會(huì)引起背景升高） 4．棄封閉液和抗體，250mlPBS漂3次，每次10分鐘 5．經(jīng)PBS最后一次漂后，將膜轉(zhuǎn)至200ml 150mmol/L NaCL, 50mmol/L Tris-CL(PH7.5)溶液托盤(pán)中，平緩搖10分鐘（切記在加入酶聯(lián)第二試劑之前須清除膜上的疊氮鈉和磷酸鹽） 6．按膜面積0.1ml/cm2加入封閉液（二抗推薦1：200-1：2000，使終濃度達(dá)0.5-5μg/ml）, 置平緩搖動(dòng)床上1h 7．將膜轉(zhuǎn)至200ml 150mmol/L NaCL, 50mmol/L Tris-CL(PH7.5)溶液托盤(pán)中，平緩搖10分鐘，重復(fù)3次，每次更新NaCL -Tris-CL 8．反應(yīng)2-3分鐘，（使用辣根過(guò)氧化物酶不可能完全排除背景，須十分小心觀察聲色反應(yīng)，一倭特異染色蛋白帶清晰可見(jiàn)，就盡快終止聲色反應(yīng)）水略為漂洗，轉(zhuǎn)入250ml PBS的托盤(pán)中。 |
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lizhijiang
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