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sunlei1981銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
對(duì)一些DNA提取方法的總節(jié)（歡迎大家補(bǔ)充討論）
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有時(shí)候提DNA不是很順，所以提出來(lái)大家討論一下，因?yàn)槲沂亲鑫⑸锏�，我首先提供一下關(guān)于微生物的DNA 提取方法，大家覺(jué)的有可以改進(jìn)的地方，歡迎討論��！ 細(xì)菌DNA的提取： （一） 試劑： 1. 抽提緩沖液 2% CTAB (W/V) 2% PVP K25 (w/v) （去色素） 100mM Tris-HCl (pH8.0) 25mM EDTA (pH8.0) 2.0M NaCl 2.10M LiCl 3. 2M LiCl 4.DEPC-water（抑制RNA酶活性） 5. 3M NaAc (pH5.2) 6. 96% 乙醇 7. 70% 乙醇 步驟： 1.抽提緩沖液65℃預(yù)熱； 2. 加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65℃，10min； 3. 加酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），振蕩，離心12,000rpm，10min； 4.取上清，加氯仿/異戊醇（24：1）振蕩，離心12,000rpm，10min； 5. 取上清，重復(fù)4步驟； 6. 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C沉淀； 11. 離心12,000rpm，10min； 12. 棄上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。 (二)（我們常用的方法，但是有時(shí)有些細(xì)菌特別不好提，就用上面的方法） 1. 將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 2. 取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。 3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h. 4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。 5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min, 將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，沉淀可稍加離心。 6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇． 真菌DNA的提取： （一） 1.取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉 2.加入4mL提取液，快速振蕩混勻 3.加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒(méi)有加酚，可以節(jié)約成本的喲�。� 4.1000rpm，4℃，5min 5.上清用體積的氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃離心5 min） 6.取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇或2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min 7.用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次, 再用無(wú)水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 ulTE中 8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃處理1 hr 9.用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃離心5 min） 10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無(wú)水乙醇, -70℃沉淀30 min以上 11.沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存?zhèn)溆?br /> DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS， 3M NaAc （二） 1.真菌菌絲0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉 2.加入3 mL 65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻65℃水浴30 min, 期間混勻2-3次 3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min 4．等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃離心5 min） 5．取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇, 混勻, 靜置約30 min 6．用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次, 再用無(wú)水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 L TE中 7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃處理1 hr 8．用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃離心5 min） 9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無(wú)水乙醇, -70℃沉淀30 min以上 10．沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> 以上是我們常用的方法． 據(jù)說(shuō)還有特別簡(jiǎn)便的一種PCR模板的制作方法，有知道的小蟲(chóng)能說(shuō)出來(lái)分享． |
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