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[求助]
PCR求助
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要擴(kuò)一個(gè)567的條帶，之前已經(jīng)有人嘗試過(guò)很多條件，但都沒(méi)擴(kuò)出來(lái)，我在他們的基礎(chǔ)上又做了很多次，最近有一次做出來(lái)，目標(biāo)條帶比較弱，引物二聚體很亮，因?yàn)橹皇窍胱鰝�(gè)基因分型，所以對(duì)條帶要求不是太高，就投入了正式試驗(yàn)，但是后來(lái)的結(jié)果非常不穩(wěn)定，條帶時(shí)有時(shí)無(wú)，向各位大俠請(qǐng)教！ 20ul體系試劑量（ul） ddH20 13.4 10X buffer 2 25mM MgCl2 1.2 10mM dNTPs 0.4 10 uM primer F1 0.4 10 uM primer R2 0.4 Taq (Promega)（5U/ul） 0.2 96°C 4min 95°C 45s 58℃ 45s 30cycles 72°C 45s 72°C 7min 下面一張是開(kāi)始摸條件時(shí)候，條帶比較弱，但還能看得見(jiàn)。 下面的是正式分型，就沒(méi)做出來(lái)，重復(fù)了很多遍，有時(shí)有一兩個(gè)，有時(shí)又沒(méi)有，同樣的模板，有時(shí)有有時(shí)又沒(méi)有。 今天把循環(huán)加到35次，還是沒(méi)有做出來(lái)。 [ Last edited by 超級(jí)小葵 on 2011-8-16 at 14:22 ] |
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kang1534
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
默默的就好
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2樓2011-08-16 14:32:03
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3樓2011-08-16 14:33:02
rioarsenal
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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4樓2011-08-16 14:58:20
5樓2011-08-16 15:26:43
ever!
新蟲(chóng) (小有名氣)
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6樓2011-08-16 15:55:03
srlee
鐵桿木蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
超級(jí)小葵(金幣+5): 謝謝，我試試看。 2011-08-16 17:21:54
dhd997(金幣+3): good 2011-08-16 18:03:41
超級(jí)小葵(金幣+5): 謝謝，我試試看。 2011-08-16 17:21:54
dhd997(金幣+3): good 2011-08-16 18:03:41
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由圖可知： 1）目的條帶比較單一，說(shuō)明引物特異性還不錯(cuò)——建議降低退火溫度用56℃看看能不能提高擴(kuò)增效率。 2）引物二聚體這么亮，引物之間可能會(huì)存在互補(bǔ)——建議PCR反應(yīng)中加點(diǎn)DMSO,或適當(dāng)減少引物濃度和gCl2的量，如果還是不行只好重新設(shè)計(jì)引物啦！ 3）PCR條帶很弱，且每次還不穩(wěn)定，這也是正常的，引物二聚體多降低了擴(kuò)增效率——建議正確配制PCR反應(yīng)體系！ 祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
7樓2011-08-16 16:05:06
8樓2011-08-16 17:23:08
空谷幽風(fēng)
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9樓2011-08-16 17:49:28
不知道啊，我是個(gè)新手。。。 10樓2011-08-17 09:10:21
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